《Scientific Reports》：Genomic characterization of Enterotoxigenic Escherichia coli lineage 2 (CS2?+?CS3) by long-read sequencing reveals distinct lineage-specific genome organization
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产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是地方性流行地区儿童、成人和旅行者腹泻的主要病因。ETEC的致病性由耐热（LT）和不耐热（ST）肠毒素以及定植因子（CFs）介导。在本研究中，研究人员对12株ETEC谱系2（L2）分离株的染色体和质粒特征进行了表征，其中包括5株首次
产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是地方性流行地区儿童、成人和旅行者腹泻的主要病因。ETEC的致病性由耐热（LT）和不耐热（ST）肠毒素以及定植因子（CFs）介导。在本研究中，研究人员对12株ETEC谱系2（L2）分离株的染色体和质粒特征进行了表征，其中包括5株首次通过长读长PacBio技术测序报道的分离株，以及7个公开可用的完整基因组。比较基因组分析揭示了一个高度保守的染色体骨架和两个核心质粒，其中CS2操纵子独特地整合到染色体中，而其他毒力决定因子，包括LT、ST、CS3、EatA、CS21和EtpBAC仍由质粒编码。谱系1样质粒的融合与整合在L2中产生了一个精简的质粒组，在保留核心毒力基因的同时，偶尔整合抗生素耐药决定因子。噬菌体质粒被零星鉴定出来，凸显了持续的水平基因获得。这些发现表明，ETEC L2采用了一种混合毒力架构，将关键定植因子的染色体固定化与质粒介导的附属性状相结合，可能增强了其稳定性和传播性。本研究为这一新兴ETEC谱系的基因组组织、进化动态和致病潜力提供了新的见解。
产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是全球范围内，特别是资源有限地区5岁以下儿童和前往地方性流行区旅行者的急性腹泻疾病的重要病因。ETEC致病性主要与质粒编码的毒力决定因子相关，包括耐热（heat-labile, LT）和不耐热（heat-stable, ST）肠毒素，以及多种介导其黏附于肠上皮表面的定植因子（colonization factors, CFs）。质粒组成和相关的毒力决定因子是特定ETEC谱系的界定特征。绝大多数ETEC感染与全球传播的谱系（L1-L7）相关，每个谱系由特定的毒素和定植因子谱定义，包括CFA/I和CS1-CS6。这些谱系通常也表现出保守的血清型。
近期研究表明ETEC感染仍然普遍，并且自2022年以来有所增加。在英格兰，2015年至2023年间ETEC感染增加了35.5%。最流行的ETEC致病型分别是表达STp和定植因子CS6的ST182 O169（L7）分离株，以及表达LT/STh和定植因子CS2?+?CS3（L2）的ST4 O6:H16分离株，这两个谱系均表现出多重耐药性。一项关于赞比亚ETEC发病率的研究报告称，LT、ST、CS2?+?CS3和CS6是分离株中最常见的毒力类型。2018年至2023年间对成人和美国军事人员旅行者腹泻的研究发现，ETEC在调查的六个地点中有五个是主要病原体。同一研究发现CS3和CS21，其次是CS2和CS6，是最常见的ETEC毒力因子。总之，这些发现表明近期全球范围内CS2?+?CS3和CS6阳性的ETEC分离株有所增加。
ETEC的抗生素耐药性在全球范围内日益增强，特别是在过去十年中出现了产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的分离株，尤其是那些表达bla
CTX-M-15的菌株。多重耐药在CS2?+?CS3 L2分离株中经常被报道，这在腹泻疾病负担高且抗生素广泛使用的地区引发了公共卫生担忧。
先前的研究表明ETEC谱系携带大型、保守的质粒，这些质粒编码毒力因子以及参与抗生素耐药和胁迫耐受的基因。在研究人员之前的研究（目前正在BMC Microbiology审稿中），对L1菌株的质粒组进行了表征，并确定了四个参与毒力的保守质粒。相比之下，L2分离株的质粒含量和基因组特征仍知之甚少，尽管初步证据表明L2菌株携带编码关键毒力因子（如LT、STh、CS3、EatA、EtpBAC和CS21）的质粒。
因此，本研究旨在表征L2分离株的染色体和质粒特征，以更好地理解其基因组多样性、致病潜力及其在抗生素耐药传播中的贡献。
本研究对12株ETEC L2分离株的基因组进行了完整测序。结果显示，所有菌株均属于血清型O6:H16，拥有一条单一的环状染色体（约4.8 Mb，GC含量约51%）和两个保守的质粒p1（115–120 kb）和p2（60–80 kb）。CS2定植因子操纵子（cotBACD）独特地整合到所有L2菌株染色体的一个保守位点，该位点两侧为插入序列和转座酶片段，其GC含量（~35%）显著低于染色体平均水平，表明其为水平获得。序列比对显示，染色体CS2操纵子与L1菌株质粒编码的CS1（cooBACD）操纵子共享约70%的核苷酸同一性。
L2菌株的质粒组发生了重塑。p1质粒是L1中独立的CS3质粒和EatA质粒融合的产物，将编码LT、STa3、CS3和EatA的基因整合于单一质粒复制子中。p2质粒携带CS21定植因子操纵子（lngX1RSTX2ABCDEFGHIJP2021）。这两个核心质粒均属于IncF家族，预测为接合型质粒。在8株菌株中还发现了携带抗生素耐药基因（ARGs）或噬菌体相关序列的附属质粒。ARGs仅存在于质粒中，包括tetB和catA1等，并与移动遗传元件相邻。噬菌体样质粒在部分菌株中被发现，编码噬菌体相关基因簇。
讨论部分指出，L2与L1具有密切的系统发育关系，但采用了截然不同的基因组策略。L2的定义性特征是CS2在染色体上的整合，这可能促进了其稳定的垂直遗传并减少了对质粒维持的依赖。尽管CS2被固定在染色体上，L2仍保留其他位于质粒上的CFs，从而形成了混合毒力架构。核心毒力质粒p1和p2的高度保守性，以及毒力基因内容的稳定，表明该谱系在长期和地理范围上保持了其核心毒力特性。抗生素耐药基因和噬菌体质粒的零星分布，与近期独立的水平获得事件一致。考虑到CS2?+?CS3阳性ETEC病例发病率的增加及其常与耐药性相关，L2可能成为重要的ETEC谱系。
本研究通过对12株ETEC L2分离株进行完整的长读长基因组表征，揭示了一种独特的谱系特异性基因组组织，其特征是染色体整合和质粒重塑。不同于谱系1完全依赖质粒的毒力架构，L2表现出定植因子CS2的染色体固定化，并携带关键毒力决定因子（包括肠毒素、CS3、CS21、EatA和EtpBAC）的保守质粒。这些保守质粒维持核心毒力功能，而抗生素耐药基因和噬菌体质粒则零星分布于附属基因组中。这些基因组特征在独立测序数据集中的保守性，突显了L2基因组架构的稳定性。这些发现共同表明，CS2的染色体固定化与精简的毒力质粒相结合，可能代表了一种增强基因组稳定性并有助于该谱系流行病学成功的进化策略。
