基于CRISPR/Cas9的精准基因编辑技术在罗非鱼体外和体内的开发

《Aquaculture》：Development of CRISPR/Cas9 based precision genome editing tools in grouper in vitro and in vivo

【字体：大中小】 时间：2026年05月28日 来源：Aquaculture 3.9

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　　张泽明|苏泽宏|程文杰|郑瑞|高杰|何建国|黄俊久|谢俊峰中国广东省海洋科学与工程技术研究院生物控制国家重点实验室、教育部基因功能与调控重点实验室、中国-东盟海洋养殖技术联合实验室、华南理工大学水产动物疾病专项实验室、中山大学生命科学学院，广州510275摘要 clustered

张泽明|苏泽宏|程文杰|郑瑞|高杰|何建国|黄俊久|谢俊峰

中国广东省海洋科学与工程技术研究院生物控制国家重点实验室、教育部基因功能与调控重点实验室、中国-东盟海洋养殖技术联合实验室、华南理工大学水产动物疾病专项实验室、中山大学生命科学学院，广州510275

摘要

clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) 系统促进了复杂遗传操作工具的发展，这些工具在基因修饰、基因表达调控等多种物种中都有应用。尽管该技术已应用于水产养殖物种，尤其是经济价值较高的海洋鱼类，但其应用仍不充分。本研究首次成功地在石斑鱼中实现了基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑。通过构建一个整合的 CRISPR/Cas9 质粒系统，我们使用 Cas9 核酶在橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）的多个基因位点（包括 tyr、mstn、hsc70 和 hsp90）诱导了突变。为了实现精确的基因编辑，我们进一步评估了多种碱基编辑器（BEs），其中 ABE8e 和 Td-BE4max 表现出优异的效果，并且未检测到明显的脱靶突变。成功构建了缺乏神经坏死病毒（NNV）受体的人源化敲除细胞系 hsc70^?/? 和 hsp90^?/?，这些细胞系表现出显著的抗病毒能力增强。考虑到实际的水产养殖需求，我们通过显微注射技术在杂交石斑鱼（E. lanceolatus♂ × E. fuscoguttatus♀）胚胎中评估了 Cas9 核酶和 BEs 的活性。通过靶向 tyr 基因，在所有测试系统中观察到受精后 4 天幼鱼的眼部和躯干区域出现色素缺陷，证实了 tyr 基因的敲除效果。总体而言，我们的发现为石斑鱼建立了一套高效的基因编辑工具，解决了当前石斑鱼基因编辑研究中的关键技术瓶颈。这一技术突破无疑将推动功能基因组学研究并加速优良水产养殖品种的分子育种。

引言

clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) 基因编辑技术是一种革命性的精确基因编辑工具，具有高效性、高准确性和易于设计的特点（Anzalone 等，2020；Manghwar 等，2019）。在该系统中，Cas9 核酶在单导向 RNA（gRNAs）的引导下靶向特定的基因组位点，并在目标位置产生双链断裂（DSBs）。通常，DSBs 可通过非同源末端连接途径修复，引入随机插入和缺失（indels），从而在靶向功能基因组区域时实现基因破坏。在存在外源性供体模板的情况下，可通过同源重组修复实现精确的基因修饰。除了由 Cas9 核酶介导的直接基因组 DNA 切割外，还开发了许多衍生的基因操作工具，包括胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）和腺嘌呤碱基编辑器（ABEs），能够在 defined 的编辑窗口内实现精确的单核苷酸转换（C 到 T 和 A 到 G）。这些工具已在动物和植物模型中得到广泛应用（Anzalone 等，2020；Li 等，2023；Liu 等，2023；Zou 等，2025）。

在鱼类物种中，CRISPR/Cas9 基因编辑技术展现出了巨大的潜力。尽管在斑马鱼（Jao 等，2013）和青鳉鱼（Ansai 和 Kinoshita，2014）等模式鱼中取得了初步进展，但其应用已扩展到经济价值较高的养殖鱼类，尤其是淡水物种。例如，尼罗罗非鱼（Jiang 等，2016；Li 等，2014；Lu 等，2022b）、渠鲶鱼（Khalil 等，2017）、南方鲶鱼（Li 等，2016）、普通鲤鱼（Zhong 等，2016）、罗非鱼（Chakrapani 等，2016）、草鱼（Ma 等，2018）、钝吻鲈（Sun 等，2020）和虹鳟（Mankiewicz 等，2022）等物种都受益于 CRISPR/Cas9 的研究。CRISPR/Cas9 技术的应用显著加速了功能基因组学研究，并促进了鱼类育种的改进（Okoli 等，2021）。例如，CRISPR/Cas9 被用于阐明尼罗罗非鱼的性别决定机制和色素模式的形成（Jiang 等，2016；Lu 等，2022b）。在草鱼细胞中，靶向敲除 jam-a 基因（该基因参与病毒进入宿主细胞的过程）使细胞对草鱼呼肠孤病毒（GCRV）感染具有抗性（Ma 等，2018）。然而，海洋水产养殖领域的发展相对滞后，大多数进展集中在大西洋鲑鱼（Datsomor 等，2019）和大黄鳍鲷鱼（Yan 等，2022）上。石斑鱼是华南和东南亚重要的海水养殖物种，但由于传染病的日益流行，其养殖规模受到限制，给渔业带来了巨大的经济损失（Chieng 等，2018；Marnis 和 Syahputra，2025；Wang 等，2023；Zhu 等，2024）。其中，由神经坏死病毒（NNV）引起的病毒性神经坏死（VNN）威胁最为严重。这种 RNA 病毒在疾病爆发期间会导致石斑鱼幼体和 juveniles 的高达 90% 的死亡率，因此 VNN 对可持续水产养殖构成了关键挑战（Bandin 和 Souto，2020；Li 等，2020）。建立抗病石斑鱼品系是应对这些挑战的根本解决方案。虽然有多种方法可用于水产养殖种质改良，但靶向基因组编辑已成为一种特别有效的方法。借鉴哺乳动物、家畜和家禽中的病毒病控制策略，敲除或修饰病毒进入受体基因已被证明是开发抗病品系的有效方法（Li 等，2024；Ma 等，2018）。迄今为止已鉴定出多种 NNV 受体（Huang 等，2020；Zhang 等，2020），这些受体为基因操作提供了有希望的目标。然而，此前尚未有针对石斑鱼物种的基因组编辑研究报道。

在此，我们报道了一个针对石斑鱼高效精确基因组编辑优化的 CRISPR/Cas9 平台。通过修改一个整合的 CRISPR/Cas9 质粒系统（Zhang 等，2023），我们在培养的石斑鱼脾脏（GS）细胞的十六个目标位点中的六个位点实现了超过 70% 的编辑效率。在此基础上，我们进一步开发了 ABEs 和 CBEs，实现了精确的碱基编辑。值得注意的是，缺乏 NNV 受体的编辑细胞表现出增强的抗病毒效果。此外，这些工具成功应用于杂交石斑鱼（E. lanceolatus♂ × E. fuscoguttatus♀）胚胎，培育出了基因编辑后的石斑鱼个体。总体而言，这些进展凸显了基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑工具在促进石斑鱼物种的基因功能研究和新品种育种方面的潜力。

章节片段

鱼类细胞培养和转染

橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）的脾脏来源细胞系（GS）由董传福先生建立，野生型 GS 和基因编辑后的 GS 细胞在含有 10% 胎牛血清（FBS；Lonsera）的高葡萄糖 DMEM（Gibco）培养基中，在 28°C 和 5% CO? 的潮湿培养箱中培养，每 3 天传代一次。

病毒感染

OGNNV-HN1（GenBank 登录号 MG874757.1 和 MG874758.1）是从中国海南收集的濒死的橙斑石斑鱼幼体中分离得到的（Lai 等，2014）。细胞

在培养的石斑鱼细胞中开发并验证基于整合质粒的 CRISPR/Cas9 系统

为了测试 spCas9（来自 Streptococcus pyogenes MGAS15252 的 Cas9，以下简称 zCas9）在石斑鱼中的活性，在此之前首先构建了一个整合质粒 pzCas9-GU6-gRNA，该质粒通过 SCMV 启动子驱动 zCas9 表达（Zhang 等，2023），并通过橙斑石斑鱼内源性 U6 启动子（GU6）驱动 gRNA 表达（Yan 等，2023）。该系统与两种同源质粒变体 pzCas9-ZU6-gRNA（ZU6，斑马鱼 U6 启动子）进行了对比

讨论

基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑工具在多物种的基因操作中表现出出色的效率、特异性和灵活性。然而，这些工具在海水养殖鱼类中的应用仍然有限。在本研究中，我们确认 Cas9 核酶及其相应的碱基编辑器在石斑鱼培养细胞和胚胎中是活跃的。为了在石斑鱼培养细胞中进行 CRISPR/Cas9 基因编辑，我们根据之前的研究开发了一个基于质粒的系统

CRediT 作者贡献声明

张泽明：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。苏泽宏：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。程文杰：验证，方法学，研究，正式分析。郑瑞：验证，方法学，正式分析。高杰：验证，方法学，正式分析。

同意参与

所有作者已经讨论了研究程序，并对相关问题表示满意，所有人都同意参与这项研究。

发表同意

所有作者都已阅读、审阅并修改了本文，所有人都同意发表这篇文章。

伦理审批

所有鱼类处理程序均遵循中山大学《实验动物护理和使用指南》的规定，并得到了中山大学的批准。

资助

本研究得到了 2025 年广东省国家重点实验室专项资金；广东省科技计划（2024B1111130003）；CARs-46 专项基金；国家自然科学基金（32573563；32273174；31972825）；广东省海洋科学与工程技术研究院（Zhumai）（SML2024SP003）的支持；以及广东省科技规划项目（2023B1212060023）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报道的工作。

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