综述：利用基于CRISPR的技术实时成像基因组动态

《Current Opinion in Chemical Biology》：Imaging genome dynamics in real time with CRISPR-based technologies

本杰明·G·亚当斯 | 吴佳慧
马萨诸塞大学阿默斯特分校分子与细胞生物学研究生项目，马萨诸塞州阿默斯特，01003，美国

基因表达是细胞功能的基本方面，驱动着多种生物过程和疾病。基因组位点之间的动态相互作用在基因调控中起着至关重要的作用。因此，可视化这些相互作用的时空动态对于阐明其功能至关重要。CRISPR-Cas技术使得许多强大的基因组成像技术成为可能。最近，已经开发出新的方法来在活细胞中成像单个或多个位点。本综述描述了基于CRISPR的基因组成像的最新进展，涵盖了背景降低、信号放大和引导RNA平铺技术。此外，还讨论了补充基于CRISPR的成像方法的荧光显微镜技术。

**引言**
自从近150年前首次观察到真核生物基因组以来[1]，研究人员一直在努力阐明其物理形态[2,3]、基因表达[4]与疾病[5,6]之间的关系。历史上，荧光原位杂交（FISH）[7, 8, 9]、操作子阵列标记[10,11]以及DNA结合蛋白的荧光标记[12,13]在研究这些关系方面发挥了重要作用。

**表1. 最新开发的基于CRISPR的基因组成像方法概述**

| 方法 | 背景降低策略 | 信号放大策略 | 多重检测能力 | 优点与局限性 | 参考文献 |
|--------------|-----------|-----------|------------|---------|--------|
| fCRISPR | 未结合FP-t的降解 | 无 | 2色（与Broccoli融合的gRNA） | 优点：降低背景信号 | [16] |
| CRISPR/Pepper-t | 未结合FP-t的降解 | 无 | 2色（与MS2-MCP） | 优点：降低背景信号 | [29] |
| CRISPR FISHer | 无 | Foldon驱动的FP凝聚体形成 | 3色（与MS2-MCP和boxB-N22肽） | 优点：单拷贝成像 | [35] |
| BRIGHT | 未结合Bi-NIR-Fb的降解 | ALFA驱动的FP凝聚体形成 | 2色（与St1 dCas9-3 × GFP） | 优点：单拷贝成像 | [36] |
| SIMBA | 无 | HP1ɑ驱动的FP凝聚体形成 | 未展示 | 优点：单拷贝成像 | [37] |
| CRISPRdelight | 无 | 通过dCas12处理的阵列进行crRNA平铺 | 4色 | 优点：单拷贝成像 | [43] |
| CRISPR PRO-LiveFISH | 无 | 用荧光标记的gRNA平铺 | 6色 | 优点：多重单拷贝成像 | [44] |

**技术细节**
- **背景降低策略**
- **信号放大策略**
- **多重检测能力**
- **优点与局限性**

**CRISPR FISHer**
- 未结合FP-t的降解
- 无
- 2色（与Broccoli融合的gRNA）
- 优点：降低背景信号
- 局限性：至少需要14个重复序列才能成像 [16]

**CRISPR/Pepper-t**
- 未结合FP-t的降解
- 无
- 2色（与MS2-MCP）
- 优点：降低背景信号
- 局限性：单拷贝成像需要BiFC [29]

**BRIGHT**
- 未结合Bi-NIR-Fb的降解
- ALFA驱动的FP凝聚体形成
- 2色（与St1 dCas9-3 × GFP）
- 优点：单拷贝成像
- 局限性：可能存在脱靶标记 [36]

**SIMBA**
- 无
- HP1ɑ驱动的FP凝聚体形成
- 未展示
- 优点：单拷贝成像
- 局限性：可能存在脱靶标记 [37]

**CRISPRdelight**
- 无
- 通过dCas12处理的阵列进行crRNA平铺
- 4色
- 优点：单拷贝成像
- 局限性：多重检测仅限于重复位点 [43]

**CRISPR PRO-LiveFISH**
- 无
- 用荧光标记的gRNA平铺
- 6色
- 优点：多重单拷贝成像
- 局限性：需要纯化的dCas9和gRNA [44]

**2013年，CRISPR-Cas成为一种强大的基因组成像工具**[14]。催化失活的Cas9（dCas9）可以与引导RNA（gRNA）结合，形成一种以可编程和序列依赖的方式靶向特定基因组位点的核糖核蛋白复合物[14]。为了给目标位点赋予荧光，可以将dCas9直接与荧光蛋白（FPs）融合[14]，或者将gRNA与RNA适配体融合以招募荧光蛋白[15]或荧光染料[16]。早期的基于CRISPR的基因组成像方法包括CRISPR-FP[14]、CRISPR-SunTag[17]和CRISPRainbow[15]。CRISPR-FP是最早的方法，它使用绿色荧光蛋白（GFP）标记的dCas9来给基因组位点赋予荧光信号[14]。CRISPR-SunTag通过在dCas9上连接一系列SunTag肽表位来扩展CRISPR-FP，这些肽表位可以与FP融合的抗SunTag纳米抗体（FP-scFvs）结合[17]。类似地，CRISPRainbow在gRNAs中嵌入了多个RNA适配体重复序列，从而招募相应的FP标记的RNA结合蛋白（FP-RBPs）[15]。这三种技术为了解基因组结构和病毒感染提供了重要的见解[18,19,20]。

尽管有许多发展，但大多数早期的基于CRISPR的基因组成像方法都集中在靶向高拷贝数的基因组位点上[14,15,17]。这有助于放大荧光信号，因为许多dCas9-gRNA复合物会在特定位点积累。虽然重复的基因组位点便于成像，但它们只代表了生物学相关目标的一部分。许多基因不包含重复序列区域（或与其不相邻）。因此，针对非重复（单拷贝）位点的成像方法对于阐明这些基因组元件的动态和功能至关重要。

本综述将重点介绍基于CRISPR的方法在成像单拷贝基因组位点方面的最新进展，以及这些方法在同时可视化多个基因组位点中的应用（详见表1）。此外，本文还将讨论荧光显微镜在基因组成像中的作用，以及共聚焦显微镜和高倾角层状光学片（HILO）显微镜的相对优缺点。

**单拷贝位点的单色成像**
在细胞中可视化基因组位点需要荧光信号远高于周围背景荧光。在单拷贝位点，每个独特的gRNA通常只能招募一个dCas9，因此目标位点的荧光蛋白积累量很少，荧光信噪比（SNR）受到细胞核中未结合荧光蛋白的影响。因此，成像单拷贝位点在技术上具有挑战性，需要策略来降低未结合荧光蛋白的背景荧光信号或增加目标结合的荧光信号。

为了降低背景荧光，已经设计了仅在目标位点激活的荧光蛋白[21]。例如，可以将荧光蛋白的一部分与dCas9融合，另一部分与靶向gRNA的RBP融合[21]，以确保荧光蛋白仅在目标位点重新组装。这些方法已被证明可以降低背景荧光，相对于CRISPR-FP而言[21]。值得注意的是，最近开发了一类使用RNA调控的不稳定结构域来降低背景荧光的新方法[22, 23, 24, 25]。在这些方法中，荧光蛋白与含有C末端Arg-Arg-Arg-Gly（RRRG）降解基序的RNA调控不稳定结构域融合，导致哺乳动物细胞中融合蛋白的快速降解[22, 23, 24, 25]。这种降解可能是由E3泛素连接酶CRL2APPBP2驱动的（至少部分如此），该酶能识别底物中的C末端RxxG基序并引发多聚泛素化和随后的蛋白酶体降解[26]。重要的是，RNA调控的不稳定结构域将RRRG降解基序定位在RNA结合位点附近，当RNA适配体结合时可以屏蔽这些降解基序[28]，从而防止CRL2APPBP2识别它们[28]，导致蛋白质稳定[22, 23, 24, 25]。这使得荧光蛋白从持续发光变为荧光响应，从而降低背景荧光[22, 23, 24, 25]。虽然这些方法最初是为RNA成像开发的[22, 23, 24, 25]，但最近的研究表明，它们可以与CRISPR-Cas9结合用于活细胞基因组成像[16,29,30]。其中一种方法是fCRISPR，它结合了第一种RNA调控不稳定结构域Pepper-tDeg和dCas9来降低基因组成像的背景荧光[16]。在fCRISPR中，Pepper适配体被插入gRNA中，可以招募并稳定tDeg标记的荧光蛋白（图1）[16]。张等人使用这种方法表明，fCRISPR可以显著提高SNR[16]。随着SNR的提高，fCRISPR可以使用单个gRNA标记少至14个重复序列的位点[16]。此外，Pepper融合的gRNA可以与荧光适配体Broccoli融合的gRNA一起使用，以同时成像两个高拷贝数的位点[16]。

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**图1. 背景降低策略。** 背景降低策略通过RNA调控的不稳定系统Pepper-tDeg（(a)和BiFC（b）以及BiFC（b）来降低未结合荧光蛋白的信号。(a) fCRISPR使用tDeg诱导非Pepper结合的tdTomato-tDeg融合蛋白的降解。当与Pepper结合时，tDeg的C末端降解基序被物理屏蔽，防止降解。(b) CRISPR/Pepper-tDeg结合BiFC（分裂的GFP）进一步降低背景信号。GFP11本身不发光，但在与GFP1-10结合后重新组装成荧光GFP1-11。**

**CRISPR/Pepper-tDeg**[29] 是另一种功能类似于fCRISPR的方法，但具有成像单拷贝位点的额外能力。为了成像单拷贝位点，CRISPR/Pepper-tDeg结合了双分子荧光互补（BiFC）[31]以进一步降低背景信号（图1）[29]。他们的特定BiFC方法[29]使用分裂的GFP[32,33]阵列，在dCas9标记的单拷贝位点重新组装。BiFC进一步降低背景荧光，使得CRISPR/Pepper-tDeg能够使用单个gRNA标记单拷贝位点[29]。

**背景降低技术的考虑因素**
除了降低背景荧光信号外，另一类成像单拷贝位点的方法利用生物分子凝聚体来放大信号[35?, 36??, 37?]。最近，三个研究小组报告了基于CRISPR的方法，通过在目标基因组位点形成凝聚体来产生明亮的荧光信号[35?, 36??, 37?]。这些方法依赖于多价相互作用来驱动相分离，使荧光蛋白在位点集中[35?, 36??, 37?]。这提供了足够的靶向荧光来可视化单拷贝位点[35?, 36??, 37?]。

**CRISPR FISHer**（由Lyu等人描述[35]）是一种基于凝聚体的策略，它使用噬菌体T4蛋白fibritin的三聚化结构域foldon来放大CRISPR成像信号[38]。由于foldon可以形成稳定的三聚体[39]，三个foldon-GFP-PP7 coat蛋白（PCP）亚单位可以组装成一个三价复合物。该复合物通过与gRNA中嵌入的两个或多个PP7适配体相互作用来招募多个dCas9-gRNA复合物[35]。这种多价组装在目标位点形成凝聚体，从而使得使用单个gRNA能够成像单拷贝位点[35]。

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**图2. 基于凝聚体的信号放大方法。** 位点特异性诱导的生物分子凝聚体放大荧光信号。(a) CRISPR FISHer使用噬菌体foldon蛋白的三聚化结构域在用dCas9与PP7 RNA标记的gRNA结合的位点形成含有GFP的凝聚体。(b) BRIGHT使用dCas9-ALFA标签通过双价miRFP670nano3标记的抗ALFA纳米抗体构建体来诱导凝聚体的形成，这些纳米抗体在未结合ALFA标签时会被降解。(c) SIMBA依赖于HP1ɑ结构域之间的多价相互作用在dCas9-SunTag标记的位点形成凝聚体。需要雷帕霉素来促进FKBP-FRB结合和随后的凝聚体形成。**

**BRIGHT** 是另一种基因组成像系统，它使用FP标记的双价纳米抗体融合蛋白来形成凝聚体以放大荧光信号（图2）[36]。在BRIGHT中，两个miRFP670nano3标记的抗ALFA纳米抗体连接形成双价融合蛋白（Bi-NIR-FbALFA）[36]。Bi-NIR-FbALFA可以特异性结合与dCas9融合的ALFA标签阵列，诱导凝聚体的形成[36]。重要的是，未结合的纳米抗体结构域会迅速诱导整个构建体的蛋白酶降解，从而降低背景信号[36]。使用BRIGHT，仅用一个gRNA就可以可视化非重复基因组位点[36]。

**SIMBA**（由Peng等人发表[37]）与CRISPR FISHer和BRIGHT不同，它利用HP1ɑ内在无序区域的多价相互作用来驱动凝聚体的形成（图2）。在SIMBA中，目标位点结合的dCas9-24xSunTag招募多个scFv-FKBP融合蛋白[37]。添加雷帕霉素可以诱导FKBP和FRB的二聚化，从而招募FRB-mCherry-HP1ɑ[37]。HP1ɑ的局部富集会诱导凝聚体的形成，从而通过招募更多的FRB-mCherry-HP1ɑ到目标位点来放大荧光信号[37]。在雷帕霉素处理后，基因组位点的标记可以迅速（约10分钟）观察到，并在雷帕霉素洗脱后缓慢消失（超过12小时）[37]。与CRISPR FISHer和BRIGHT类似，SIMBA仅用一个gRNA就足以可视化单拷贝位点[37]。

需要注意的是，雷帕霉素可能会影响哺乳动物细胞的信号传导和生长[40]。雷帕霉素的效果取决于剂量和细胞类型[40,41]，对此的全面讨论超出了本综述的范围。以下参考文献提供了相关概述[40, 41, 42]。在雷帕霉素活性可能成为问题的情况下，可以使用不需要雷帕霉素的恒活性SIMBA版本。

虽然基于凝聚体的信号放大方法可以使用单个gRNA实现单拷贝成像，但它们存在脱靶标记的风险。如描述BRIGHT的论文中所述，当gRNA具有脱靶结合活性或构建体在高水平表达时，可能会在非目标位点形成凝聚体[36]。开发CRISPR FISHer、SIMBA和BRIGHT的研究小组能够在哺乳动物细胞培养中减轻脱靶标记[35?, 36??, 37?]。然而，在将这些技术应用于不同的细胞系或生物体时，可能需要重新评估脱靶标记的问题。

**单拷贝位点的多色成像**
单拷贝位点的多色成像对于解决基因与远端调控元件之间相互作用的时间和空间动态的关键问题至关重要。虽然基于凝聚体的方法能够实现对单拷贝基因座的成像[35?, 36??, 37?]，但将其扩展到同时多基因座成像可能具有挑战性，并且可能需要正交的dCas9蛋白，以确保每个凝聚体仅在相应的基因座处形成。为了解决这个问题，已经在感兴趣的基因座上铺展多个gRNA，这被证明是一种有效的替代方法，可以实现多色成像并放大荧光信号[43,44]。在gRNA铺展中，设计了一组带有不同间隔序列的gRNA，每个间隔序列针对目标基因座附近的特定DNA序列。通过表达多个gRNA，可以招募大量荧光团到基因组位点，从而增强微弱的靶向荧光信号。Chen等人首次报道了gRNA铺展的早期版本，他们使用大量慢病毒转导的gRNA对单拷贝基因座进行了成像[14]。尽管从理论上讲gRNA铺展非常适合多重标记，但由于实际限制，直到最近才得以实现。2024年，Yang等人使用CRISPRdelight大大简化了gRNA铺展技术，该方法结合了dCas12a的crRNA阵列处理能力和序列特异性DNA结合能力（图3）[43]。在CRISPRdelight中，表达了一个由直接重复序列分隔的crRNA阵列（这些重复序列引导切割）[43]。阵列转录本被dCas12a切割成单个crRNA，这些crRNA引导dCas12a到达目标基因座[43]。CRISPRdelight仅使用12个crRNA就成功标记了单拷贝的CCAT1基因座[43]。此外，在crRNA中添加适配体序列还可以实现对重复基因座的多色成像[43]。总体而言，CRISPRdelight结合了质粒表达RNA的便利性和gRNA铺展的强大功能，一旦构建了质粒，就可以直接应用[43]。

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图3. gRNA铺展方法。gRNA铺展使用多个gRNA针对每个目标基因座来增强荧光信号生成。(a) CRISPRdelight利用dCas12a的天然RNA切割能力将crRNA阵列处理成单个crRNA，这些crRNA引导dCas12a到达目标基因座。切割用剪刀符号表示。在crRNA中添加适配体序列（如PP7和MS2）可以同时标记多个基因座。(b) CRISPR PRO-LiveFISH使用预先与dCas9组装的荧光标记IVT gRNA进行成像。不同颜色的gRNA池（每个gRNA针对特定基因座）被用来实现多基因座追踪。

虽然gRNA可以通过质粒和病毒在细胞中表达，但也可以通过体外转录（IVT）产生，并与dCas9预组装后直接递送到细胞中[45]。这为使用带有小分子荧光团的荧光标记gRNA提供了可能性[45,46]。为此，CRISPR PRO-LiveFISH[44]采用了一种基于非天然碱基对（UBP）[47]的方法来生成带有小分子荧光团的gRNA池，使得使用比以往方法更少的gRNA池就能实现对非重复基因座的成像。由于荧光团直接连接到gRNA上，因此可以通过将不同基因座靶向的间隔序列与不同的荧光团配对来实现多色成像[44]。组合标记技术通过两个或多个彩色点的重叠来识别目标基因座，从而将可标记的基因座数量增加到六个[44]。总体而言，CRISPR PRO-LiveFISH提供了一个简化的平台，用于同时成像多个单拷贝基因座[44]。

上述方法主要通过改变CRISPR-Cas9向目标基因座传递荧光信号的方式来提高基因组成像的信噪比（SNR）。然而，可观察到的SNR还受到显微镜技术和荧光团光物理特性的影响。即使采用相同的基因组成像策略，显微镜参数（如光学切片、激发几何形状和背景抑制）也会影响从基因组位点获得的SNR。同样，荧光团的光产率和光稳定性也会随时间影响SNR的大小。因此，荧光显微镜和荧光团设计的进步为改善基因组成像提供了互补的途径。

在荧光显微镜中，可以通过控制(a)被照亮的样本部分或(b)到达探测器的光部分来提高SNR。高倾斜层状光学切片（HILO）显微镜通过仅照亮样本内的有限区域来解决(a)问题[48,49]。有限的照明体积减少了未结合荧光团的激发，从而降低了背景噪声。然而，必须校准光角度以获得最佳性能，这对于体积成像来说可能具有挑战性，因为样本中不同Z平面的最佳角度可能不同。激光扫描共聚焦显微镜通过减少到达探测器的失焦光来解决(b)问题[50]。不过，这种方法的主要缺点是采集时间延长[50]。旋转盘共聚焦显微镜是一种替代方案，可以在减少失焦光的同时缩短采集时间[50]。总体而言，HILO和共聚焦显微镜的缺点被它们显著降低的背景信号所抵消。

提高荧光产率是另一种通过进一步减少背景信号来改善基因组成像的方法。例如，新开发的荧光团BD666-HTL的亮度与JF549-HTL相当，但其荧光产率提高了约2倍[51,52]。另一种最近报道的荧光团MaP618-HTL的光产率更高，在与HaloTag结合时荧光强度增加了1000倍[53]，而JF549-HTL仅增加了约35倍[52]。需要注意的是，BD666[51]和MaP618[53]的光稳定性尚未进行测量。如果光稳定性有限，那么亮度和荧光产率的提高可能会被抵消。因此，未来对BD666和MaP618的研究应包括对其光稳定性的评估，并在必要时进行优化。

除了荧光产率外，光稳定性对于维持长时间成像实验中的SNR也至关重要。PF555是一种新的、高度光稳定的染料，其光漂白速度比Alexa Fluor 555慢约13倍，比JF549慢35倍[52]。这使其成为广泛使用的JF染料的潜在替代品，尽管其亮度略低[52]。总体而言，最近开发的PF-、BD-和MaP系列染料在光物理特性方面的改进可能超过了可能的缺点。这些染料具有更高的亮度、更低的背景信号和更强的光稳定性，有助于研究基因表达和细胞周期等关键过程中的基因组结构动态。

真核基因组具有复杂的三维结构，了解这种结构随时间的变化对于理解基因组结构如何影响基因表达以及如何导致疾病至关重要。基于CRISPR的方法已成为活细胞基因组成像的强大工具。最近的进展通过减少背景荧光[16,29]和增强目标结合荧光信号[35?, 36??, 37?]，大大扩展了基因组成像的范围。尽管取得了这些进展，但同时多基因座的多色成像仍然具有挑战性。在这方面，gRNA铺展技术有助于推动多基因座成像的发展[43,44]。值得注意的是，通过结合正交的RNA调控不稳定结构域[22,23,25]与现有的背景荧光减少方法（如fCRISPR[16]和CRISPR/Pepper-tDeg[29]），可以实现单拷贝基因座的多色成像。未来，继续开发正交标记策略以及荧光显微镜和荧光团的进步将是可视化基因组复杂结构的关键。