《Journal of Proteome Research》：Automated Microvolume Secretome Proteomics Enables Sensitive and Deep Profiling and Noninvasive Single-Embryo Analysis
编辑推荐：
细胞持续向胞外空间释放蛋白质形成分泌组(secretome)，其可动态、生物信息丰富且非侵入性地反映细胞功能状态。然而传统分泌组蛋白质组学通常需大于2 mL的大体积样本，鉴定深度有限，且单日处理通量低于30个样本。研究人员开发了一种自动化微体积分泌组分析工作流
细胞持续向胞外空间释放蛋白质形成分泌组(secretome)，其可动态、生物信息丰富且非侵入性地反映细胞功能状态。然而传统分泌组蛋白质组学通常需大于2 mL的大体积样本，鉴定深度有限，且单日处理通量低于30个样本。研究人员开发了一种自动化微体积分泌组分析工作流程，整合优化的样本前处理与基于磁珠的蛋白质组样本制备，仅需少于20 μL的条件培养基即可实现超过3000种蛋白质的深度覆盖，样本处理通量超过每日96个。利用该流程，研究人员从微升级培养液中实现了高深度、时间分辨的分泌组分析，捕获了分泌组的时序变化。进一步将该技术应用于小鼠单细胞胚胎培养液，每个胚胎稳定鉴定超过200种分泌组蛋白。值得注意的是，Sdc4与Ooep在各发育阶段均被检出，凸显了单细胞胚胎水平非侵入性分泌组分析的潜力。综上，本研究建立了稳健且可扩展的超微量输入样本高深度分泌组分析框架，将基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的分析适用范围拓展至微尺度与纵向生物学应用。
该研究发表于《Journal of Proteome Research》。研究背景方面，分泌组由细胞释放至胞外的全部蛋白质组成，涵盖经典分泌途径产物、细胞外囊泡及膜脱落相关蛋白，可动态反映细胞转录活性、应激反应、代谢状态与分化轨迹，是细胞功能状态的重要非侵入性指标。当前基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的分泌组蛋白质组学存在三大瓶颈：一是样本需求量高，常规方法需毫升级起始体积；二是鉴定深度有限，低丰度分泌蛋白回收效率低；三是通量不足，单日处理样本数通常低于30个，难以支撑微尺度培养体系与纵向时序研究的需求。
研究人员通过开展方法开发与多场景验证，建立了集成浓度-复溶(concentration-reconstitution, CRC)样本前处理与强阴离子交换(strong anion-exchange, SAX)磁珠自动化制备的微体积分泌组工作流程。核心结论显示，该流程仅需少于20 μL条件培养基即可实现超3000种蛋白质的鉴定深度，单日处理通量突破96个样本，且成功应用于细胞时序分泌动态监测与单细胞胚胎非侵入性分子评估，为微量样本的纵向蛋白质组学研究提供了标准化解决方案。
关键技术方法方面，研究人员首先以人胚肾293T(HEK293T)细胞为模型，系统比较丙酮沉淀、直接酶解与CRC三种前处理策略的蛋白回收率、鉴定深度与重复性，筛选出最优预处理方案。其次基于Opentrons Flex液体处理机器人，对比羟基修饰磁珠与季铵盐修饰SAX磁珠在低起始体积下的捕获性能，确定SAX磁珠对低丰度、囊泡来源蛋白的富集优势。研究纳入小鼠体外受精胚胎队列，按2细胞、4细胞、桑椹胚、囊胚阶段分组，同步设置空白培养基对照排除背景干扰。所有样本经LC-MS/MS数据采集后，采用Spectronaut软件进行库非依赖直接DIA(directDIA+)分析，结合R语言完成生物信息学统计与功能富集。
研究结果部分，第一项“微体积约束下分泌组预处理策略的分析学评估”显示：CRC方法在起始体积≥15 μL时蛋白回收率最高，2 mL大体积下平均鉴定4016个蛋白组，显著高于丙酮沉淀(3285个)与直接酶解(3595个)；其预处理稳定性最优，中位数变异系数(CV%)仅为15.5%，且高丰度与低丰度蛋白的定量一致性均优于其余两种方法，确定为自动化前处理的最优方案。
第二项“SAX磁珠在低起始体积下实现更高分泌组覆盖度”表明：SAX磁珠的鉴定深度随起始体积增加而显著提升，100 μL体积下可鉴定超过3100个蛋白组，较羟基磁珠(约2045个)提升约50%；仅需羟基磁珠20%的用量即可覆盖其检出的全部蛋白，并新增1239种独有蛋白；功能富集显示SAX磁珠优先捕获参与RNA加工剪接、细胞器定位及囊泡运输的分泌蛋白，尤其适用于低体积样本的微量分泌组分析。
第三项“自动化微体积分泌组分析支持最小扰动的时间分辨研究”证实：仅采集20 μL培养液即可实现HEK293T细胞无血清培养后3、5、7、12、24小时的时序监测；鉴定蛋白数从3小时(平均3358个)至7小时保持稳定，12小时(3939个)与24小时(4537个)显著上升，主成分分析(PCA)显示各时间点样本聚类紧密且随时间点推移明显分离；软聚类(Mfuzz)分析识别出4种表达模式，分别对应RNA代谢相关蛋白的延迟上调、早期应激适应相关蛋白的短暂高表达、密度依赖的细胞间相互作用相关蛋白的渐进升高，精准捕捉了细胞对环境变化的动态响应。
第四项“超低输入条件下的单细胞胚胎非侵入性分泌组分析”显示：单个小鼠胚胎35 μL培养液中取20 μL即可稳定鉴定约220种分泌蛋白，各发育阶段共有361种共享蛋白，涉及嘌呤代谢、细胞器定位与泛素依赖蛋白降解通路；鉴定出56种阶段特异性表达蛋白，其中Sdc4在囊胚阶段特异性高表达，Ooep、Tle6等皮层下母源复合体组分随发育渐进升高，早期高表达的Afdn、Rab10等可能参与合子基因组激活(ZGA)，为胚胎质量评估提供了候选非侵入性分子标志物。
讨论与结论部分指出，本研究建立的自动化微体积分泌组工作流程突破了传统方法的样本量与通量限制，兼具高灵敏度、高重复性与可扩展性。时序分析验证了其对细胞动态分泌行为的捕获能力，单细胞胚胎应用则证明了其在临床胚胎筛选领域的转化潜力。该框架兼容多种培养体系，为微尺度生物学过程的蛋白质组学研究提供了通用技术平台，推动了分泌组学在基础研究与临床诊断中的应用。
