《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：PCR profiling of tumor-associated microorganisms in tissue of primary epithelial malignant tumors of colorectal origin: associations with key clinicopathological characteristics
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引言：结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，微生物组研究对于推进肿瘤生物学理解、支持生物标志物开发和微生物组靶向干预具有巨大潜力。大多数结直肠癌微生物组研究依赖于粪便或黏膜采样，但常规病理档案中包含大量福尔马林固定、石蜡包埋的原发肿瘤组织，这些组织可用
引言：结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，微生物组研究对于推进肿瘤生物学理解、支持生物标志物开发和微生物组靶向干预具有巨大潜力。大多数结直肠癌微生物组研究依赖于粪便或黏膜采样，但常规病理档案中包含大量福尔马林固定、石蜡包埋的原发肿瘤组织，这些组织可用于大规模评估肿瘤相关微生物。方法：研究人员使用靶向定量PCR（qPCR）技术，对来自192名患者的原发性结直肠腺癌样本中的肿瘤相关微生物进行了分析，并通过非参数检验、有序回归、正则化逻辑回归以及基于排列推断的谱内轮廓排序等方法，评估了微生物与临床病理变量（肿瘤分化分级、原发肿瘤T分类和疾病分期）之间的关联。结果：最一致的信号与肿瘤分化相关，而非分期。在G2–G3级与G1级的肿瘤比较中，显示出更高的总细菌负荷和更高的瘤胃球菌属（Ruminococcus spp.）检出率，这两种关联在错误发现率（FDR）校正后仍然显著；回归分析证实了这些发现。一个正则化逻辑模型对高级别（G2-G3）疾病实现了中等判别力（平均受试者工作特征曲线下面积 ≈0.71），并产生了一个以总细菌负荷和瘤胃球菌属检出为主，辅以其他低频菌属贡献（需谨慎解释）的紧凑特征谱。相比之下，针对原发肿瘤T分类、浸润性（T1–T2 vs T3–T4）或总体分期的模型判别性能较低（曲线下面积 ≤0.59），且谱内轮廓距离分析未揭示各组之间稳健的全局分离。结论：对存档原发肿瘤组织的靶向qPCR分析能够识别出与肿瘤分化分级关联强于分期的、可重复的微生物信号，表明组织细菌负荷和特定菌属可能反映了与G2–G3级和G1级对比相关的微环境特征。更广泛的肿瘤微生物组分析对于捕获多样性并优化具有临床信息价值的特征谱是必要的。
本研究利用靶向定量PCR技术，对结直肠癌患者的福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织进行了微生物组分析。研究发现，肿瘤组织中的微生物信号与肿瘤的分化程度（即分化等级）关联最为紧密和稳健，而非传统上更受关注的肿瘤分期或浸润深度。具体而言，中/低分化（G2–G3级）肿瘤组织相较于高分化（G1级）肿瘤，表现出显著更高的总细菌负荷以及更高的瘤胃球菌属（Ruminococcus spp.）检出率，这一发现在控制多重比较、排除小样本亚组偏倚以及校正临床病理混杂因素后仍然成立。基于这些微生物标志物构建的预测模型对高级别肿瘤显示中等判别能力（平均AUC约0.71），但判别性能有限。相反，试图区分不同浸润深度（T1–T2 vs T3–T4）或总体疾病分期（早期 vs 晚期）的微生物特征谱模型均表现出较低的判别性能（AUC ≤0.59），未能发现稳健的、具有全局区分性的微生物群落模式。这些结果表明，在原发性结直肠癌组织中，肿瘤分化等级是一个比临床分期更关键的、与肿瘤内微生物特征相关联的临床病理维度。
为完成上述分析，研究人员主要采用了以下关键技术方法：从192例结直肠腺癌患者的福尔马林固定石蜡包埋组织块中提取DNA；使用Colonoflor Premium商业试剂盒进行靶向qPCR检测，该试剂盒针对30个细菌类群及1个真菌靶标进行定量分析；应用了一系列统计方法，包括非参数检验、有序逻辑回归、正则化（L1/LASSO）逻辑回归模型构建与嵌套交叉验证，以及基于中心对数比转换的谱内轮廓距离分析和主坐标分析。
**研究结果**
**分析不同分化程度（分级）的原发上皮恶性肿瘤组**
研究人员将肿瘤按分化程度分为低级别（G1）和高级别（G2–G3）两组进行比较。定量分析显示，高级别肿瘤的总细菌负荷显著高于低级别肿瘤。定性（存在/缺失）分析表明，瘤胃球菌属在高级别肿瘤中的检出率显著高于低级别肿瘤。回归分析进一步支持了上述发现，表明更高的总细菌负荷和瘤胃球菌属的检出与高级别肿瘤状态独立相关。敏感性分析将比较限制在G1与G2级肿瘤之间，证实了这些核心关联并非完全由G3亚组驱动。多变量逻辑回归模型在调整年龄、性别、肿瘤位置和AJCC分期等协变量后，总细菌负荷和瘤胃球菌属检出与高级别状态的关联仍然显著。基于正则化逻辑回归的预测模型对高级别疾病表现出中等判别性能，最终特征谱包括总细菌负荷以及瘤胃球菌属、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）和解木聚糖 Roseburia inulinivorans的检出。谱内轮廓距离分析显示，高级别组与低级别组在微生物群落结构上无清晰分离。
**分析按原发肿瘤分期分层的组别**
研究人员评估了微生物特征与原发肿瘤浸润深度（T分类）的关系。将肿瘤分为非浸润性（T1–T2）和浸润性（T3–T4）两组。定量分析显示总细菌负荷随T分类增加有下降趋势，但组间差异在校正多重比较后不显著。定性分析未发现显著差异。有序逻辑回归提示 Citrobacter spp. 和 Enterobacter spp. 的检出与更晚期的T分类有正相关趋势，但同样未通过FDR校正。预测模型对区分非浸润性与浸润性肿瘤的判别性能较低。谱内轮廓距离分析未显示两组间微生物群落模式存在显著差异。
**分析按结直肠癌分期分层的组别**
研究人员评估了微生物特征与总体疾病分期（I-IV期）的关系。虽然总细菌负荷在分期间的总体比较有显著趋势，但校正多重比较后不显著，且在晚期（IV期）有降低的迹象。有序逻辑回归显示总细菌负荷与疾病分期存在负相关趋势（OR < 1），但未通过FDR校正。对变异普罗维登斯菌/奇异变形杆菌（Proteus vulgaris/Proteus mirabilis）检出的分析也呈现与分期的负相关趋势，但同样不显著。试图区分早期（I–II期）与晚期（III–IV期）疾病的预测模型判别性能低。谱内轮廓距离分析同样未识别出能区分早期与晚期疾病的整体微生物特征模式。
**讨论与结论**
本研究的主要发现是，在应用于原发肿瘤组织的靶向微生物qPCR分析中，最显著且统计学上最稳健的差异与肿瘤分化等级相关，而非疾病分期或原发肿瘤T分类。总细菌负荷作为组织细菌负荷的整合指标，可能反映了肿瘤微环境中细菌DNA的积累程度。瘤胃球菌属在结直肠癌背景下具有高度异质性，其作用取决于具体菌种，本研究发现其检出与分化等级相关。总体而言，本研究数据表明，要在此方向上取得进一步进展，需要扩大微生物检测范围，以更全面地了解肿瘤相关微生物组并评估α多样性指标。鉴于研究材料为福尔马林固定石蜡包埋组织，16S rRNA基因测序是未来一个有前景的方向。
本研究存在若干局限性：回顾性设计、低分化亚组样本量小、福尔马林固定石蜡包埋材料可能引入DNA片段化等偏倚、未纳入污染监控对照、未进行宿主DNA标准化，以及使用的商业试剂盒针对FFPE组织应用的性能未经独立验证。因此，研究结果应被视为对肿瘤相关微生物DNA的探索性关联分析，而非对瘤内微生物组的完整特征描述。最终结论指出，靶向定量PCR分析存档原发肿瘤组织，能够识别出与肿瘤分化等级（而非分期）关联更强的、可重复的微生物信号，表明组织细菌负荷和特定菌属可能反映了与G2–G3级和G1级对比相关的微环境特征。更广泛的肿瘤微生物组分析对于捕获多样性并优化具有临床信息价值的特征谱是必要的。
