食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)中m6A与自噬相关长链非编码RNA(lncRNA)预后特征模型的构建及验证——用于预测生存及调控肿瘤免疫微环境

《Frontiers in Immunology》：Development and validation of an m6A and autophagy related lncRNAs signature for predicting survival and modulating the immune microenvironment in esophageal squamous cell carcinoma

目的(Objective)：本研究旨在建立基于m6A与自噬相关长链非编码RNA(m6A- and autophagy-related lncRNAs, m6aARLncs)的预后框架，以提升食管鳞状细胞癌(ESCC)患者的生存预测精度，并阐明该预后框架在调控肿瘤免疫微环境中的作用。方法(Methods)：研究人员采用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)转录组数据与基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)数据分别作为训练队列与独立验证队列；m6A相关基因(m6A-related genes, m6aRGs)引自已发表文献，自噬相关基因(autophagy-related genes, ARGs)取自人自噬数据库(Human Autophagy Database, HADb)；通过整合共表达分析与差异表达分析筛选差异表达的m6aARLncs(DE-m6aARLncs)，采用单变量Cox回归与最小绝对收缩与选择算子(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, LASSO)回归构建预后风险特征(risk signature)；通过风险热图、生存分析、受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线、差异分析及独立预后分析验证模型效能，评估风险评分(riskScore)与临床特征的关系；进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)阐释生物学意义；通过肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)分析、免疫细胞相关性分析、单样本基因集富集分析(single-sample Gene Set Enrichment Analysis, ssGSEA)及免疫检查点谱分析评估风险特征对免疫微环境的影响；开展单细胞测序数据分析及药物敏感性分析；提出可能的m6A-自噬-lncRNA调控轴；通过逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)验证m6aARLncs的mRNA表达水平。结果(Results)：研究人员建立了基于5个m6aARLncs(LINC00847、UBL7-AS1、LINC01554、LINC00601及FAM222A-AS1)的稳健风险预后模型，该模型对ESCC患者总生存期(overall survival, OS)具有显著预测效能。综合免疫分析显示高危组独特免疫表型特征为肥大细胞、B细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells, pDCs)、辅助性T细胞及肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)和人白细胞抗原(human leukocyte antigens, HLA)等浸润特征；单细胞测序部分验证了B细胞、中性粒细胞及树突状细胞的发现；免疫检查点分子TNFRSF18与LAIR1的表达与风险分层显著相关；药物基因组学分析鉴定出紫草素(Shikonin)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、苔藓抑素-1(Bryostatin-1)、埃博霉素B(Epothilone-B)、JNK-9L、LFM-A13、QS11、VX-680及Z-LLNle-CHO在高低危亚组间具差异敏感性；提出含5个m6aARLncs、5个m6aRGs及21个ARGs的m6A-自噬-lncRNA调控轴可能参与ESCC发病；RT-qPCR验证FAM222A-AS1、LINC00601、LINC00847、LINC01554及UBL7-AS1在ESCC细胞中表达上调。结论(Conclusion)：本研究结果对完善ESCC预后分层及解析免疫景观具重要临床意义，为更精准的预后评估与靶向治疗干预策略制定提供新视角。

论文解读：《Development and validation of an m6A and autophagy related lncRNAs signature for predicting survival and modulating the immune microenvironment in esophageal squamous cell carcinoma》

一、研究背景与意义

食管癌(esophageal cancer, EC)是侵袭性强、致死率高的恶性肿瘤，其中食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)占全球病例近90%，常因晚期确诊导致治疗效果差，且缺乏明确的分子靶点。N6-甲基腺苷(N⁶-methyladenosine, m⁶A)是最主要的RNA表观转录组修饰，调控RNA稳定性、翻译及剪接，其失调参与多种肿瘤发生发展。自噬(autophagy)作为II型程序性细胞死亡具双刃剑作用，在早期抑制肿瘤、在进展期被肿瘤劫持促进存活，并可影响ESCC肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment, TIME)。目前尚无系统整合m⁶A修饰与自噬过程构建ESCC专属风险分层模型的研究。为此，研究人员开展本研究，基于m⁶A与自噬相关长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA; m⁶A- and autophagy-related lncRNAs, m6aARLncs)构建并验证ESCC预后特征模型，并探讨其对TIME的调控作用。该论文发表于《Frontiers in Immunology》。

二、主要关键技术方法概述

研究人员以TCGA-ESCC数据集(81例肿瘤、11例正常)为训练队列，GEO数据集GSE53624(119例配对)与GSE53625(179例配对)为独立外部验证队列；从文献收集23个m⁶A相关基因(m⁶A-related genes, m6aRGs)，从人自噬数据库(Human Autophagy Database, HADb)获取222个自噬相关基因(autophagy-related genes, ARGs)；通过Pearson相关系数|r|>0.3且P<0.001的共表达分析分别筛选m⁶A相关lncRNA(m6aRLncs)与自噬相关lncRNA(autophagy-related lncRNAs, ARLncs)，取交集得m6aARLncs；经单变量Cox回归筛选预后相关m6aARLncs，LASSO回归降维构建5-lncRNA风险评分(riskScore＝Σ_i=1ⁿ(lncRNA_{exp_i}×coef_i))，按中位数分为高危/低危组；采用风险热图、Kaplan–Meier生存分析、时间依赖ROC曲线、单因素/多因素Cox回归验证独立预后价值；进行ESTIMATE算法评估TME、多种反卷积算法(CIBERSORT、TIMER、XCELL、EPIC)及ssGSEA分析免疫细胞浸润，检测免疫检查点分子差异表达；利用pRRophetic包预测化疗药物半数抑制浓度(IC₅₀)；基于GSE196756行单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析(Seurat v5流程质控、Harmony批次校正、SingleR注释)；提出m⁶A-自噬-lncRNA共表达调控轴；用RT-qPCR(引物见原文表1)在KYSE30、KYSE180及正常食管上皮细胞NE2中验证lncRNA表达。

三、研究结果

3.1 m6a和自噬相关LncRNAs related to ESCC

研究人员对222个ARGs与lncRNAs共表达分析获709个ARLncs，对23个m6aRGs共表达分析获333个m6aRLncs，二者交集得到323个与ESCC相关的m6aARLncs。

3.2 Construction of risk prognostic model

单变量Cox回归从323个m6aARLncs中筛选出15个与ESCC预后显著相关的m6aARLncs(均具肿瘤-正常差异表达，即DE-m6aARLncs)；LASSO回归最终确定5个最优预后标志物——LINC00847、UBL7-AS1、LINC01554、LINC00601、FAM222A-AS1。计算riskScore后TCGA训练队列分为高危(n=40)和低危(n=40)，GSE53624分为高危(n=60)/低危(n=59)，GSE53625分为高危(n=90)/低危(n=89)。

3.3 Validation of the risk prognostic model

风险热图显示高低危组具明显分子表达差异；KM生存分析示高危组OS显著差于低危组(TCGA、GSE53624、GSE53625均P<0.05)；ROC曲线显示riskScore预测效能优于年龄、TNM分期等常规临床参数(AUC较高)；5个DE-m6aARLncs在高低危组间差异表达，部分在验证队列中可复现；单因素及多因素Cox回归证实riskScore是ESCC独立预后因子(P<0.001训练队列，P<0.01验证队列)。

3.4 Clinical features analysis

风险分层模型在男性、T1–2期、N0期、M0期及I–II期各临床亚组中均具显著生存区分能力，表明模型具广泛临床适用性。

3.5 Gene set enrichment analysis(GSEA)

高危组显著富集细胞黏附分子(cams)、肾素血管紧张素系统、1型糖尿病、病毒性心肌炎及补体与凝血级联通路；低危组显著富集同源重组、叶酸一碳池、RNA降解、细胞周期及基础转录因子通路。

3.6 Tumor microenvironment analysis

ESTIMATE算法显示高危组免疫评分(ImmuneScore)及综合评分(ESTIMATEScore)均显著高于低危组，基质评分(StromalScore)组间无显著差异。

3.7 Immune cell correlation analysis

riskScore与活化髓样树突状细胞、M1/M2巨噬细胞、CD4⁺T细胞、活化肥大细胞浸润呈正相关；与B细胞(初始及浆细胞)、CD4⁺Th2细胞浸润呈负相关。

3.8 Single sample gene set enrichment analysis(ssGSEA)

高危ESCC患者相对于低危者显著富集肥大细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞(pDCs)、辅助性T细胞及肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)浸润，HLA相关通路及副炎症(parainflammatory)反应活性升高。

3.9 Differential analysis of immune checkpoints

训练队列中9个免疫检查点基因在高低危组间差异表达，其中TNFRSF18(GITR)