综述：大麻素受体CB1与CB2的结构洞察：配体选择性的决定因素

《Frontiers in Chemical Biology》：Structural insights into cannabinoid receptors CB1 and CB2: determinants of ligand selectivity

　　

大麻素受体1（CB1）与大麻素受体2（CB2）是内源性大麻素系统（ECS）的核心组分，在神经信号传导、免疫调节及炎症反应等多种生理过程的调控中发挥关键作用。二者同属A类G蛋白偶联受体（GPCR）家族，但组织分布与信号特征存在显著差异，既是极具吸引力的药物靶点，也为亚型特异性药物研发带来挑战。由于CB1与CB2序列与结构高度相似，配体交叉反应普遍，亚型选择性配体的设计长期受限。近年来结构生物学的进展已解析出多种功能状态下的CB1与CB2高分辨率结构，为解析受体选择性的分子基础提供了新契机。本综述对CB1与CB2结构开展了系统的比较分析，重点探讨配体结合残基、结合口袋拓扑结构及理化环境的差异，这些差异可能影响亚型选择与信号转导。分析表明，CB1倾向于容纳体积更大、柔性更高的配体，而CB2偏好更小、更紧凑的化学型。此外，位置保守但化学性质不同的残基（如CB1的Leu3.29对应CB2的Ile3.29，以及CB1的Leu6.51对应CB2的Val6.51）揭示了可影响配体结合与受体激活的细微结构差异。总体而言，本研究旨在为下一代大麻素配体的理性设计提供依据，以提升受体选择性、降低副作用并增强治疗潜力。

大麻素受体CB1与CB2的结构概述

CB1与CB2均具有GPCR家族典型的七次跨膜螺旋折叠特征。CB1由472个氨基酸组成，CB2相对较短，由360个氨基酸组成。A类GPCR的氨基酸残基通常采用Ballesteros-Weinstein（B.W.）编号系统标注，该系统由两个数字构成：第一位表示跨膜螺旋序号，第二位表示该残基相对于该螺旋最保守残基的位置，最保守残基被指定为50位。CB1与CB2的正构配体结合口袋位于跨膜结构域内，并受胞外环塑形影响，而螺旋束的胞内侧则形成G蛋白偶联及下游信号转导的界面。二者整体结构的相似性暗示其具有共同的结合模式或作用机制。序列差异主要集中在N端、C端及胞外环2（ECL2），其中ECL2在配体结合中发挥重要作用。

研究表明，胞外区不仅是结构连接部分，还主动参与受体功能。ECL2可直接参与配体结合与受体激活，同时影响受体折叠与转运，并可能引导配体进入结合口袋。此外，CB1 N端的膜近端区域可通过变构机制调节配体结合，保守半胱氨酸形成的二硫键会影响受体-配体相互作用与协同性。从进化角度看，CB1在物种间序列高度保守，而CB2的保守性相对较低。

大麻素受体配体通常按来源分为植物大麻素、内源性大麻素与合成大麻素，也可按化学结构分为经典大麻素、非经典大麻素、氨基烷基吲哚与类二十烷酸型。植物大麻素如Δ⁹-四氢大麻酚（THC）与大麻二酚（CBD）源自大麻植物；内源性大麻素如花生四烯酸乙醇胺与2-花生四烯酰甘油由机体自身产生；合成大麻素则是用于探索受体功能或开发药物的广泛类似物。结构上，经典大麻素是以Δ⁹-THC及其合成类似物HU-210为代表的二苯并吡喃衍生物；非经典大麻素缺乏经典大麻素的吡喃环，具有双环或三环核心；氨基烷基吲哚如R-(+)-WIN-55,212含有吲哚骨架；类二十烷酸则是花生四烯酸衍生的长链脂肪酸，属于柔性脂质分子而非刚性多环体系，但仍可有效作用于CB1与CB2。这些多样的结构类别体现了可调控CB1与CB2的化合物的化学多样性，是其广泛药理效应的基础。

CB1的首个蛋白质数据库（PDB）结构于2016年提交，CB2的首个结构于2019年提交。研究人员共分析了13个CB1与8个CB2的配体结合三维结构，为避免冗余，每个独特的配体-受体复合物仅保留一个代表性结构，优先选择分辨率最高的条目。13个CB1结构中，5个通过X射线晶体学解析，8个通过冷冻电镜解析；8个CB2结构中，1个通过X射线晶体学解析，其余通过冷冻电镜解析。部分结构引入了纳米抗体、抗体片段（如scFv16）、黄素氧还蛋白或糖原合酶片段等稳定元件以增强受体稳定性并辅助结构解析。CB1与CB2的配体结合结构汇总显示，7个CB1复合物与异源三聚体G蛋白共解析，其中5个与G_i结合，1个与G_s结合，其余为无G蛋白结合的配体-受体结构，反映受体的失活或预激活状态；8个CB2结构中，7个与异源三聚体G_i蛋白共解析，1个为无G蛋白结合的配体-受体结构。

CB1与CB2主要偶联G_i/o蛋白，抑制腺苷酸环化酶并激活MAPK信号通路。但CB1的信号转导更具多样性，还可偶联G_s与G_q通路，而CB2的信号主要限于G_i/o偶联，信号谱相对局限。在已解析的13个CB1结合配体中，3个为经典大麻素，其余分别来自非经典大麻素、氨基烷基吲哚、二芳基吡唑、乙醇酰胺类及5种结构多样的小分子，拓展了CB1配体的已知化学型空间。CB2结构的配体集较小但化学类型多样，8个配体中2个为经典大麻素类似物，各1个为非经典大麻素与氨基烷基吲哚骨架，其余约50%为新型CB2选择性化学型，超出了传统大麻素框架。整体来看，大多数实验解析的受体-配体复合物仍集中于经典或密切相关的大麻素骨架，但新型化学型的出现反映了研究者正尝试探索可增强受体选择性与功能多样性的非传统骨架。

配体结合位点结构

结构分析表明，CB1与CB2的配体主要结合于同一共同位点，即天然大麻素（如THC与CBD）结合的类大麻素结合口袋。尽管二者整体折叠高度保守，配体特异性相互作用可导致局部口袋环境出现细微差异。研究人员将距离结合配体5.0 ?范围内的残基定义为结合口袋，并对其进行系统分析。

在配体结合的CB1中，14个残基出现在至少11个（约85%）复合结构中，称为高频残基；CB2中则有22个残基出现在至少7个（约87%）结构中，为高频残基。结合频率低于此阈值的残基称为低频残基。已有突变数据证实，多个高频结合位点残基的丙氨酸替换会显著降低激动剂结合亲和力或效力，降幅从约4倍到超过200倍不等，而ECL2残基Phe268的突变会导致配体结合丧失与受体信号受损，说明这些高频残基在配体识别与受体激活中具有重要作用，为比较CB1与CB2的结合口袋特性提供了基础。

这些结合位点残基通过介导分子间相互作用直接影响配体结合能力，包括疏水残基提供范德华接触与形状互补，促进脂溶性配体部分的容纳；极性及带电残基形成氢键与静电相互作用，稳定特定配体构象；部分残基则通过维持口袋几何结构与构象完整性间接调节配体可及性与结合效率。这些相互作用共同定义了结合口袋的理化环境，决定了不同配体的识别与滞留效率。

尽管可用结构数量较少，CB2的结合口袋残基数量多于CB1（22对14），提示CB2口袋更大，配体可采取更多结合取向并与更灵活的残基相互作用；CB1口袋相对较小，配体结合姿态与相互作用模式更为相似。高频残基中，CB1的极性（21.4%对18%）与带电残基（7.1%对4.5%）比例略高于CB2，而非极性残基在CB2中更丰富（77.2%对71.4%），表明CB2口袋相对更疏水，有利于与亲脂性配体相互作用，而CB1的极性与带电残基可支持更多的氢键或静电相互作用。这一差异与早期计算及突变研究结果一致，即CB2比CB1更依赖其疏水亚域内的芳香堆积相互作用。例如，Δ⁸/Δ⁹-THC的C1酚羟基对CB1结合重要，可作为氢键供体，但对CB2并非必需。进一步研究显示，去除酚羟基并不会像之前假设的那样降低受体亲和力，CB1可通过重新定向配体，使吡喃氧与Lys192形成代偿性氢键，说明酚羟基虽有助于结合但并非绝对必需，体现了CB1结合口袋的适应性。Lys192被认为是CB1配体亲和力的关键氢键伙伴，定点突变研究证实，将其替换为丙氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸会显著降低多种CB1激动剂的结合亲和力。然而结构分析显示，Lys192仅在13个CB1晶体结构中的7个中与配体相互作用，说明其对配体结合重要但非必须。静态晶体学数据仅能提供受体-配体相互作用的部分视图，未来分子动力学与基于集合的分析可进一步揭示Lys192在配体识别与激活过程中的瞬时作用。

通过叠加最高分辨率的CB1与CB2结构并重点比较结合口袋，研究人员发现二者口袋残基大多占据等效位置，表明类大麻素结合口袋的整体拓扑在两种受体间高度保守，这也为亚型选择性配体的设计带来了挑战。但仔细检查可发现少数位置等效但化学性质不同的残基，如CB1的Leu^3.29对应CB2的Ile^3.29，CB1的Leu^6.51对应CB2的Val^6.51。这些非极性替换保留了疏水性，但侧链长度的差异可能微调口袋几何结构，即使这种保守变化也可能改变侧链堆积，从而影响大体积或延伸配体的容纳。实验证据支持这些差异的功能相关性：丙氨酸扫描突变显示，Leu^3.29及附近H2/H3区域的残基突变为丙氨酸会显著降低激动剂CP55,940的结合亲和力；而位于6.51位的残基（CB1为Leu^6.51，CB2为Val^6.51）在配体依赖性受体激活中起关键作用——CB1中Leu^6.51突变为Val会消除THC介导的受体激活，而CB2中Val^6.51突变为Leu则可恢复THC对CB1样激活，说明即使是单个保守替换也可直接影响配体效力与亚型选择性，确定6.51位是决定大麻素受体激活的关键位点。

除残基水平差异外，结合口袋的大小与体积差异也是理解受体选择性的重要因素。基于PDB的实验结构数据，CB1结合配体的分子量可达约590 Da，而CB2结合配体通常更小，一般不超过450 Da，提示口袋尺寸与灵活性可能是亚型选择性的影响因素之一。此前研究也表明，配体刚性与疏水性差异可影响受体偏好，更紧凑、更疏水的配体倾向于偏好CB2；而长链大麻素激动剂对CB1的结合亲和力高于CB2，支持CB1可容纳更大、更柔性的配体。

为进一步量化口袋特征，研究人员计算了所有配体结合结构的溶剂可及表面积（SASA）与溶剂排除表面（SES）。SASA代表可被溶剂分子接近的总分子表面积，反映表面开放程度；SES定义排除溶剂渗透的分子边界，反映口袋致密性与原子堆积。结果显示，与CB1结合配体分子量范围更广一致，CB1配体结合口袋的SASA范围（2626–3421 ?²）与平均值（3113 ± 215 ?²）均大于CB2（2964–3087 ?²，平均3030 ± 43 ?²），表明CB1口袋适应性更强，可结合更多样化的化合物；CB2口袋则更紧凑、空间约束更强，与配体的形状互补性要求更高。SES结果呈现相似趋势，CB1的SES范围与离散度均大于CB2，提示其表面拓扑更具构象变异性与灵活性。不过，这些结论应谨慎解读，因为现有结构集较小且不平衡，CB1结构数量远多于CB2，可能引入偏差并限制结论的普适性。

尽管CB1与CB2结合口袋并无显著结构反差，但口袋几何、残基组成与理化环境的细微差异可被策略性利用以提升亚型选择性。特别是可通过调整配体大小、形状与柔性匹配口袋约束：CB1通常适合大体积、高柔性配体，CB2偏好小体积、紧凑骨架。针对位置等效但化学性质不同的残基（如Leu^3.29/Ile^3.29与Leu^6.51/Val^6.51）进行靶向修饰，可促进差异性结合并提升选择性。实现受体选择性不仅需要优化与目标受体的相互作用，还需最小化与非目标受体的亲和力，这可能受受体构象动力学差异的影响。计算研究表明，受体激活机制也贡献于选择性：CB1结合口袋在激活过程中发生显著构象变化，部分由N端波动驱动，而CB2口袋相对稳定；因此CB2选择性配体可与CB2的多种亚稳态结合，而对相应CB1状态的亲和力较低，从而降低总体CB1结合。这些激活依赖性的口袋体积差异为改善成药性提供了洞见，深入理解口袋动力学对大麻素药物发现具有重要意义。通过结合结构与计算分析，谨慎平衡配体的极性与疏水官能团，可为开发高选择性CB1或CB2调节剂提供可行路径。

结合口袋的疏水性质还可通过溶剂介导的热力学效应促进配体结合。被困在狭窄疏水口袋中的水分子往往氢键结合不充分，处于能量不利状态；配体结合时置换这些结构化水分子在热力学上是有利的，可解除不利的配体-水及水-口袋相互作用，并使释放的水分子在体相溶剂中形成更强的氢键网络，从焓与熵两方面贡献结合亲和力，这也解释了在受限结合环境中引入亲脂性取代基常带来显著亲和力提升的原因。

另一种实现亚型选择性的策略是变构调节。与正构配体不同，变构调节剂结合于拓扑上独立且保守性较低的位点，可实现更高的受体亚型选择性，并有机会精细调控信号偏向性。目前已通过计算与实验技术在两种受体中鉴定出多个推定变构位点：CB1的变构区域分布于跨膜与胞内结构域，包括TM3–6–7界面、TM1/TM4之间的口袋及N端环区；CB2的推定变构位点位于正构结合口袋邻近区域及跨膜区内。根据对正构配体驱动信号的作用，变构调节剂可分为正向与负向变构调节剂，分别增强或减弱受体活性。代表性化学类别包括CB1的吲哚-2-甲酰胺衍生物、二芳基脲与2-苯基吲哚类，而CB2的变构调节剂类别相对较少，如2-氧代吡啶-3-环庚烷甲酰胺衍生物。

值得注意的是，结合于CB1的配体非诺贝特（PDB ID: 8K8J）虽解析为正构结合，但在更高浓度下表现出变构调节作用，被认为可能通过双位结合（同时占据正构与变构区域）发挥负向变构调节剂活性，且这种调节作用所需的浓度高于其主要正构活性浓度。

未来展望

CB1与CB2在人类健康相关的多种生理过程中发挥关键作用。由于二者整体结构高度相似，设计仅选择性作用于单一受体而不影响另一受体的配体十分困难。目前已报道的大多数大麻素配体选择性有限，CB1与CB2的效力差异仅为数倍。解析这些细微选择性差异需要全面的受体结构洞见，但现有结构数据存在局限。由于CB1发现更早，大多数三维结构为CB1结合复合物，CB2结构相对较少，这种不平衡可能导致比较分析偏倚，并限制关于CB2特异性相互作用的结论。扩充CB2结构库并在膜环境中研究受体行为，有望揭示有利于选择性配体结合的构象。未来整合进化分析、结构建模与动态模拟的研究，对全面理解受体选择性的机制至关重要。

此外，CB1在物种间高度保守，而CB2进化分化更快，人与大鼠CB2的序列一致性仅约81%，这种分化尤其在C端与胞外区可能显著影响配体结合、信号效力与受体调控。因此在将临床前模型的配体活性与治疗结果转化至人类时，必须考虑这些种间差异。未来针对类大麻素口袋附近残基的突变与结合研究，可阐明微环境变化如何微调配体识别，指导开发更具选择性的大麻素受体调节剂。

在利用CB1与CB2结构差异提升亚型选择性的同时，限制中枢神经暴露仍是减少CB1激活相关不良反应的关键。近期药物化学与结构设计的进展表明，通过调节极性与电荷等理化性质，可有效限制血脑屏障穿透并促进外周选择性。将这些药代动力学考量与结构洞见相结合，为开发安全性更高、疗效更好且中枢副作用更低的大麻素治疗药物提供了互补策略。

近年来，DiffDock、MaSIF与PIGNet等深度学习与几何建模框架已成为预测配体亲和力与选择性的有力工具。这些模型直接从结构数据中学习三维几何与理化互补性，可更准确地预测结合姿态与亲和力。重要的是，通过评估表面互补性或低置信度相互作用评分，这类模型可帮助识别不太可能有效结合的配体，这对CB1与CB2尤为相关——二者的活性位点高度相似，仅在细微理化特征上存在差异，而这些差异可能影响选择性。

CB1与CB2仍是未来药物发现的重要靶点。二者紧密相关的结构以及结合口袋中微小但功能显著的差异，为精准利用这些微变异设计配体提供了宝贵机遇。随着结构生物学、分子建模与药理学研究的持续进展，这两种受体将继续成为下一代实现组织特异性和功能选择性大麻素调控的核心焦点。

除大麻素系统内的受体选择性外，还需考虑配体与其他受体家族的潜在脱靶相互作用。例如，某些大麻素相关化合物（如CBD）已被报道可与血清素能系统相互作用，包括对5-HT_1A受体的激动剂活性。这种多药理行为可能参与其观察到的生物学效应，是未来全面表征配体在CB1与CB2之外活性的重要考量方向。