ADGRD1(黏附G蛋白偶合受体D1，亦称GPR133)通过PI3K/AKT/mTOR介导的促血管生成分泌组促进膀胱癌进展及血管新生

《Frontiers in Oncology》：ADGRD1 promotes bladder cancer progression and angiogenesis via the PI3K/AKT/mTOR-mediated pro-angiogenic secretome

　　

背景(Background)：膀胱癌(Bladder cancer, BLCA)仍是癌症相关死亡的主要原因之一，尤其在中晚期及转移阶段。明确驱动肿瘤侵袭性的分子机制对开发靶向治疗至关重要。黏附G蛋白偶合受体D1(Adhesion G protein–coupled receptor D1, ADGRD1，又名GPR133)是一类孤儿aGPCR，近期被报道参与肿瘤发生，但其在膀胱癌中的作用及下游机制尚不清楚。 方法(Methods)：研究人员利用GEPIA3数据库中的TCGA BLCA数据集分析ADGRD1的临床意义(临床分期及预后)。建立稳定敲低及过表达ADGRD1的BLCA细胞系，采用qPCR、蛋白质印迹(Western blot)、CCK-8、克隆形成、伤口愈合、Transwell及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管实验评估增殖、迁移、侵袭及血管生成。通过异种移植瘤模型评估体内肿瘤生长。蛋白质印迹检测PI3K/AKT/mTOR通路活化状态，并使用SC79(AKT激活剂)及LY294002(PI3K抑制剂)进行功能验证。 结果(Results)：ADGRD1在晚期、高级别BLCA中显著高表达，是总生存期(Overall Survival, OS)及无进展间期(Progression-Free Interval, PFI)差的强预测因子。功能实验显示ADGRD1促进BLCA细胞体外增殖、迁移、侵袭及内皮成管，并在体内促进肿瘤生长及血管新生。ADGRD1高表达细胞通过上调富含VEGF、PDGF及IL-8的分泌组增强内皮成管。机制上，ADGRD1激活PI3K/AKT/mTOR信号级联(通路组分磷酸化水平升高)，药物抑制PI3K/AKT/mTOR可逆转ADGRD1的致癌及促血管生成效应。 结论(Conclusions)：本研究确定ADGRD1是BLCA中关键的进展相关驱动因子。ADGRD1通过调控PI3K/AKT/mTOR信号轴及促血管生成微环境促进肿瘤生长及新生血管形成，有望成为晚期BLCA的预后生物标志物及治疗靶点。

本文对发表于《Frontiers in Oncology》的论文《ADGRD1 promotes bladder cancer progression and angiogenesis via the PI3K/AKT/mTOR-mediated pro-angiogenic secretome》进行解读总结。

【研究背景】

膀胱癌(Bladder cancer, BLCA)是全球泌尿系统常见恶性肿瘤，晚期或转移性患者预后极差，中位生存期仅约15个月，肿瘤复发、浸润及远处转移是长期控制的主要障碍。PI3K/AKT/mTOR信号通路在超过40%的BLCA中存在异常激活并与不良预后密切相关，但其上游调控机制尚未完全阐明。黏附G蛋白偶合受体(Adhesion G protein–coupled receptors, aGPCRs)家族近年被发现参与肿瘤生长、转移及血管重塑，其中ADGRD1(亦称GPR133)作为孤儿aGPCR已在胶质母细胞瘤中被报道具有致癌作用，但其在膀胱癌中的生物学功能及信号机制完全未知。鉴于GPCR信号与PI3K/AKT/mTOR激活存在已知联系，研究人员假设ADGRD1可能是BLCA中该通路的上游调控因子，并通过生物信息学分析及体内外实验予以验证。

【主要关键技术方法】

研究人员基于TCGA BLCA队列(n=405)使用GEPIA3平台进行ADGRD1表达与临床分期、总生存期(OS)及无进展间期(PFI)的生存分析，并做ADGRD1与血管标志物CD31(PECAM1)、CD34的Spearman相关性分析。选用高低不同基线ADGRD1表达的BLCA细胞系(5637、RT112、HT1376、T24、UMUC1、253JBV)及HUVEC，构建慢病毒介导的稳定ADGRD1敲低(shRNA)及过表达细胞株。通过CCK-8、克隆形成、伤口愈合及Transwell实验检测细胞增殖、迁移与侵袭；收集条件培养基(Conditioned Medium, CM)进行HUVEC体外成管实验，并以qPCR检测VEGF、PDGF、IL-8等促血管生成因子mRNA水平。Western blot检测ADGRD1、PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT、mTOR/p-mTOR及血管内皮标志物蛋白表达。利用BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型评估体内成瘤及血管密度(CD31、CD34免疫荧光)；采用PI3K抑制剂LY294002及AKT激活剂SC79进行药理挽救实验验证通路依赖性。所有实验重复至少三次独立生物学重复，统计学采用t检验或单因素方差分析。

【研究结果】

ADGRD1 expression is elevated in bladder cancer and correlates with poor prognosis

通过分析TCGA及GEO数据集并结合临床分期分层发现，ADGRD1 mRNA及蛋白水平在III/IV期及高级别BLCA组织中显著高于早期及低级别肿瘤；高ADGRD1表达患者OS(HR=1.59)及PFI(HR=1.46)明显缩短。qPCR及Western blot证实ADGRD1在转移性BLCA细胞系(T24、253JBV、UMUC1)中表达高于非侵袭株(5637、RT112、HT1376)，表明ADGRD1与肿瘤恶性程度及不良预后正相关。

ADGRD1 promotes proliferation, migration, and invasion of bladder cancer cells

在253JBV及T24细胞中敲低ADGRD1显著降低细胞活力(CCK-8)、克隆形成能力、伤口愈合迁移率及Transwell迁移和侵袭数；在低表达5637细胞中过表达ADGRD1则产生相反的促进作用，证实ADGRD1可促进BLCA细胞增殖、迁移及侵袭。

ADGRD1 enhances angiogenesis through paracrine effects on endothelial cells

TCGA数据分析显示ADGRD1与CD31、CD34表达呈正相关(R=0.59、0.53)。HUVEC经ADGRD1高表达BLCA细胞条件培养基处理后成管分支数增加，经ADGRD1敲低细胞条件培养基处理则减少；伴随HUVEC中CD31、CD34蛋白表达相应变化。qPCR显示ADGRD1敲低下调BLCA细胞中VEGF、PDGF及IL-8 mRNA，过表达则上调，说明ADGRD1通过旁分泌富促血管生成因子(含VEGF、PDGF、IL-8)的分泌组促进内皮细胞血管形成。

ADGRD1 accelerates tumor growth and angiogenesis in vivo

裸鼠皮下移植瘤实验中，ADGRD1敲低组肿瘤体积增长缓慢、终末瘤重减轻，Ki-67增殖指数降低；过表达组肿瘤增大、Ki-67升高。免疫荧光显示敲低组移植瘤微血管密度标记CD31、CD34表达下降，过表达组上升，证实ADGRD1在体内促进BLCA生长及肿瘤血管新生。

ADGRD1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

Western blot结果显示，ADGRD1敲低降低253JBV及T24细胞中p-PI3K、p-AKT(Ser⁴⁷³)、p-mTOR蛋白水平，过表达ADGRD1则升高5637细胞中上述磷酸化水平；移植瘤组织中也得到一致的体内验证，表明ADGRD1激活PI3K/AKT/mTOR信号级联。

Inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling reverses ADGRD1-mediated malignant phenotypes

使用AKT激活剂SC79可挽救ADGRD1敲低引起的增殖、迁移、侵袭及HUVEC成管抑制；使用PI3K抑制剂LY294002可取消ADGRD1过表达所致的促癌及促血管生成效应，证明PI3K/AKT/mTOR信号轴是ADGRD1介导致癌及促血管生成作用的必需下游效应通路。

【讨论与结论翻译】

讨论指出，本研究首次揭示ADGRD1在BLCA中作为癌基因驱动因子，通过激活PI3K/AKT/mTOR通路促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭，并通过上调含VEGF、PDGF及IL-8的促血管生成分泌组以旁分泌方式诱导内皮细胞血管新生。ADGRD1在BLCA中并非普遍较正常尿路上皮上调，而是随肿瘤进展(晚期/高级别/转移)特异性升高，提示其更可能作为"进展开关(progression switch)"而非启动因子，高表达可稳健预测不良预后。研究局限性包括未使用永生化正常尿路上皮细胞对照、未在同株细胞内进行双向遗传操作、ADGRD1近端偶联G蛋白亚型(Gα_s/q、β-arrestin)及配体激活机制尚需进一步阐明。

结论(Conclusions)：综上所述，本研究确定ADGRD1是膀胱癌中与进展相关的致癌调节因子，通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肿瘤生长及血管新生。靶向ADGRD1或其下游信号通路可为晚期BLCA提供新的治疗途径，该结果拓展了对黏附G蛋白偶合受体(aGPCRs)在肿瘤生物学中作用的认识，并为ADGRD1在肿瘤治疗中的转化研究提供了依据。