综述：血管化复合组织同种异体移植的诊断模式：从组织病理学至多模态策略

《Frontiers in Immunology》：Diagnostic modalities in vascularized composite allotransplantation: from histopathology to multimodal strategies

背景：面部与肢体血管化复合组织同种异体移植（VCA）可在严重创伤后重建形态与功能，但与其他移植领域类似，其发展仍受限于诊断工具的精准性。现行监测依赖皮肤活检组织学，该方法可识别急性细胞性排斥反应，却无法有效检出抗体介导排斥及慢性排斥。十余年的临床经验显示，现有方法存在持续性的诊断缺口，包括采样偏倚及观察者间判读差异。 方法：研究人员回顾了已发表的人VCA相关组织病理学、分子及影像学研究方法，旨在总结诊断进展并明确新兴工具。 结果：2022版Banff分类修订引入了血管修饰因子，以表征慢性血管损伤。对比研究表明，黏膜排斥可能早于或重于皮肤排斥。供者来源游离DNA（dd-cfDNA）、microRNA（miRNA）谱、蛋白质组学与转录组学面板等分子检测在早期、微创检测中展现出潜力。 讨论：VCA诊断面临的核心挑战包括中心间活检判读的差异性、缺乏经过验证的分子与生物标志物标准，以及多模态数据向临床工作流程整合不足。需要协调的多中心努力以标准化评估流程，提升早期、准确诊断能力。

引言

血管化复合组织同种异体移植（VCA）通过面部与肢体移植，能够在严重创伤后重建患者功能与外观，但其长期发展仍受制于排斥监测与诊断工具的局限性。移植物长期存活依赖于对免疫介导损伤的早识别，而当前评估主要依赖基于Banff分类的皮肤活检组织病理学。该体系聚焦于急性细胞性排斥，尚未涵盖抗体介导或慢性排斥形式——这在当时可用病例中尚无法明确界定。单纯组织学可能无法全面反映组织特异性免疫反应，皮肤、黏膜与示踪皮瓣之间的潜在差异进一步增加了诊断变异性。尽管如此，无论是2007年框架还是2022年更新版，Banff分类仍是指导VCA排斥诊断与管理的金标准与基石。本微型综述总结了人VCA当前的诊断策略，同时讨论了Banff分类的最新更新，以及迈向标准化多中心协作的路径，以期提升诊断精度与长期监测水平。

组织病理学及基于组织的诊断

2007年Banff工作组分类是含皮肤VCA排斥组织病理学诊断中验证最充分的基础，至今仍是金标准。该分类制定时，全球仅报道了41例VCA受者（3例面部、28例手部、9例腹壁、1例带皮肤岛的膝关节）。分级系统描述了不同级别的T细胞介导排斥，但因当时病例有限，尚未纳入对其他组织（如黏膜）、抗体介导及慢性排斥的评估。与肢体VCA不同，大多数面部同种异体移植物包含口腔与鼻腔黏膜，关注这些额外上皮部位的免疫活性可改善面部VCA（fVCA）排斥的整体评估。单纯皮肤活检组织学评估存在缺陷：操作有创、可能导致瘢痕形成，且因非随机部位选择易产生采样偏倚，从而不能准确反映疾病严重程度与分布。虽然黏膜活检同样存在部位选择局限，但其优势在于取材自内部表面，通常不会遗留可见瘢痕。在皮肤之外评估第二种上皮表面，能够更全面地反映同种异体移植物内的排斥活动，尤其在排斥呈斑片状或不同移植物组织间不一致时更为显著。区分轻度与中度炎症具有主观性，观察者间变异性限制了判读一致性。尽管存在局限，Banff分类仍是评估fVCA排斥的金标准，2022年Banff会议调查参与者均认为原始Banff标准对评估VCA排斥具有重要意义。2007年分类依据三项特征对急性细胞性排斥分级：上皮淋巴细胞浸润；表皮改变（包括海绵水肿与角质形成细胞凋亡）；血管周炎症伴或不伴淋巴细胞外渗至上皮或毛囊皮脂腺单位。标准4mm穿刺活检行苏木精-伊红染色：0级仅见非特异性轻微炎症；1级为轻度表浅血管周浸润，无表皮受累；2级为中度浸润伴淋巴细胞外渗或海绵水肿，但无角质形成细胞坏死；3级为真皮-表皮交界致密带状炎症，伴角质形成细胞凋亡、角化不良或角质溶解；4级为明显表皮坏死。

黏膜与示踪皮瓣活检

fVCA独特地包含黏膜这一上皮表面，其正日益被确认为排斥的主要靶器官。与仅依靠皮肤监测的肢体移植不同，fVCA允许同时对皮肤与黏膜进行监测。Banff系统尚未定义黏膜标准，但多个团队已提出适应性方案。组织学特征与皮肤平行：0级罕见淋巴细胞；1级血管周浸润；2级界面淋巴细胞性粘膜炎（±海绵水肿）；3级角质形成细胞凋亡；4级坏死。研究团队及其他学者证实，细胞毒性T细胞参与皮肤与黏膜的排斥过程，且在黏膜中观察到B细胞浸润，其相关性仍在研究中。早期研究表明，黏膜炎症可能早于或长于皮肤改变。口腔黏膜因上皮修复加速与纤维化减少而愈合迅速且瘢痕轻微。多家中心已将黏膜活检纳入常规监测。然而，黏膜分级标准由皮肤标准外推而来，且易受机械创伤或感染干扰，因此并行皮肤活检仍有助于排除黏膜假阳性结果并评估慢性真皮改变。筋膜皮肤示踪皮瓣（如移植时置于远位的供者来源桡侧前臂皮瓣）可提供额外组织用于临床监测与活检以评估排斥。黏膜与示踪皮瓣的研究结果表明，评估多个组织部位比单纯皮肤评估更能全面反映移植物免疫病理变化。

Banff 2022修订：应对局限性与血管改变

Banff 2007体系聚焦于急性细胞性排斥，未纳入当时尚未明确定义的抗体介导与黏膜形式。长期经验显示，血管炎症与重塑是急慢性VCA病理的重要相关表现。为此，2022年Banff工作组修订了2007年框架，纳入了既往标准未能涵盖的血管损伤与慢性改变。为填补这些缺口，2022版Banff引入了伴随急性T细胞介导排斥分级的血管修饰因子。血管炎（v0-v3）指内皮下的单个核细胞浸润，依据内膜炎症或坏死程度分级；同种异体移植物血管病变（av0-av2）测量内膜增厚与管腔狭窄程度；毛细血管血栓（t0-t1）记录小血管血栓的有无。这些修饰因子（例如III级，v2）扩展了体系，可同时传达血管损伤的严重程度与慢性化程度。由于此类病变常累及深层真皮或皮下血管，标准4mm穿刺活检可能遗漏，因此工作组建议加深采样并结合互补成像。此次修订还将血管狭窄、动脉炎与微血管血栓认定为重度急性排斥的标志，并可能是慢性损伤的指标。与此一致的是，Lian等对大量面部移植物活检的分析证实，排斥过程中T淋巴细胞是浸润的主要成分，靶向微血管及富含干细胞的表皮与毛囊皮脂腺单位区。

慢性排斥与长期监测

VCA中的慢性排斥尚未在Banff分类中正式定义，但已被确认为一种渐进性、免疫介导的过程，可导致结构与功能性移植物恶化。其表现为移植物血管病变、真皮硬化、附属器萎缩与纤维化。组织学特征包括内膜增生、血管闭塞、带状淋巴组织细胞浸润、网脊消失、附属器缺失及真皮胶原沉积增加。分子水平上，慢性排斥涉及细胞毒性T细胞与巨噬细胞的持续活化，炎症细胞因子如IFN-γ、CXC趋化因子CXCL9-11及AP-1通路组分JUNB与FOS的上调，以及IDO1与STING等通路的激活。这些免疫与代谢通路与急性面部同种异体移植物排斥中观察到的相似，其中IFN-γ与IDO1信号伴随细胞毒性T细胞活化。慢性排斥的诊断依赖于将临床进程与组织学及血管特征相结合，但可靠的诊断阈值仍未确定。由于深层动脉与皮下血管常受累，标准4mm活检可能遗漏这些变化，加深采样与成像或可改善检出率。持续的挑战包括与急性排斥的重叠、缺乏经验证的生物标志物，以及对向慢性疾病转化的认识不足。

组织部位与采样模式的比较评估

鉴于当前组织学采样的局限性，多项研究比较了VCA中不同组织部位的诊断效能。皮肤因其可视且免疫原性强，一直被用作VCA急性细胞性排斥组织病理学评估的主要组织。近期证据表明，皮肤并不总能准确反映更深或其他复合组织（如黏膜或肌肉）中的排斥情况。fVCA研究显示，黏膜排斥可独立发生或较皮肤排斥更严重，仅依赖皮肤活检可能无法检测到移植物其他组分中的重要免疫事件。然而，黏膜炎症与肌肉或大血管等更深移植物区室排斥的直接相关性证据仍然有限，黏膜改变是否能预测深部组织损伤仍在研究中。在一组手移植系列中，即使皮肤活检为Banff 0-1级，严重的动脉内膜增厚与肌肉纤维化仍导致移植物失功。各模式均有诊断权衡。面部皮肤活检可及、验证充分且有成熟Banff标准支持，但有创、可能留疤，且在移植物内排斥呈斑片状时易受采样偏倚影响。黏膜活检提供了额外的上皮组织，易于取材，但在fVCA中可能比面部皮肤本身更具挑战性。黏膜或可检测fVCA中的早期或不一致排斥，但同样因黏膜受累的斑片状与不连续性而存在采样偏倚，且分级标准由皮肤外推而来，结果可被机械创伤或局部感染（如CMV）干扰。因此，黏膜应被视为皮肤活检的补充，其固有价值与生物学机制仍需进一步验证与阐明。示踪皮瓣允许在不损毁原发移植物的前提下从远位取材活检，可较好地捕捉中重度排斥，但对低级别改变的辨别力下降，且可能不总是与原发移植物内的事件同步。在21次急性排斥发作的比较分析中，黏膜与皮肤排斥分级呈强相关（r=0.72），黏膜的阴性预测值高达约0.85，并可检测到数次皮肤漏诊的排斥发作。示踪皮瓣（如桡侧前臂皮瓣）与面部皮肤相关，但平均分级较低且阴性预测值约0.76，漏诊约24%的病例。近期一项14例同步面部同种异体移植物与示踪皮瓣活检的配对分析显示，9对分级完全相同，5对存在差异。示踪皮瓣对中重度排斥追踪良好，但对1级与无排斥的鉴别力降低，同时在基因表达层面与面部移植物共享3级排斥相关的细胞毒性转录程序与T细胞克隆。这些发现提示，皮肤活检对急性细胞介导排斥敏感，但可能遗漏更深或并行的组织损伤，支持采用多模态方法，结合黏膜与深层采样以实现更准确的排斥检测与管理，同时也应认识到每种模式均有其诊断局限，需进一步验证。

生物标志物与多模态方法

血清学与免疫组织化学标志物正逐步纳入监测策略。在9例fVCA受者的队列中，5例出现供者特异性抗体（DSA）。当DSA与C4d沉积同时阳性时，急性排斥分级倾向于更高，但慢性排斥发生于2例DSA阳性与2例DSA阴性患者，仅1例移植物失功。因此，单独使用DSA的预测价值有限。其他辅助手段如基因表达谱、循环细胞因子（如MMP3）、红外热成像与高频超声正在探索中，其诊断准确性仍有待验证。现有证据表明，结合临床评估、黏膜与皮肤活检及免疫学生物标志物的多模态策略，或可改善面部与肢体VCA中急慢性排斥的检测，并有助于个体化调整免疫抑制方案。

分子与生物标志物方法

实体器官移植中建立的分子诊断方法为VCA排斥监测提供了有前景的工具。循环供者来源游离DNA（dd-cfDNA）可作为同种异体移植物损伤的标志物，并在心脏、肾脏与肺移植中可准确检测急性排斥。开创性研究显示，dd-cfDNA水平升高与排斥发作相关，且往往出现在临床或组织学证据之前。近期多中心研究将dd-cfDNA动态变化与肾移植中的抗体介导排斥及结局联系起来，凸显了其早期诊断敏感性。这些发现证明了dd-cfDNA在VCA中的转化潜力，在该领域早期、微创监测可改善长期移植物结局。然而，dd-cfDNA仅是同种异体移植物损伤的标志，而非排斥所特有，无法区分排斥与感染、缺血或其他组织损伤。在VCA中，其解读还可能受移植物大小与组织构成变异性的影响，且经验证的阈值与前瞻性效能数据仍不明确，需在VCA中开展前瞻性验证。microRNA（miRNA）正成为肾、肝及VCA移植中颇具前景的生物标志物。循环特征如miR-155、miR-146a、miR-21-5p、miR-340-5p、miR-145-5p与miR-195-5p可区分耐受与排斥状态，针对这些miRNA的反义寡核苷酸疗法正在研发中。血清细胞因子与趋化因子，包括CXCL9、CXCL10、CXCL11与IL6，可指示免疫活化并与急慢性排斥相关。高通量蛋白质组平台如Olink可检测这些细胞因子网络及更广泛的蛋白损伤特征，其在VCA中的验证正在进行。微创方法如皮肤胶带剥离检测与黏膜拭子可实现基因与蛋白表达的连续分析，揭示局部免疫反应，并可能检出传统皮肤为中心的方法漏诊的排斥事件。在fVCA中，黏膜采样可能尤为有价值，因为其独特的基因表达谱可提示皮肤中未见到的排斥模式。基于组织的分子检测，包括基因表达面板、空间转录组学与T细胞受体（TCR）测序，可对免疫细胞浸润与活化进行高分辨率表征。NanoString等基因表达谱平台及Banff分子诊断工作组面板已在肾与心脏移植中对模糊组织学进行重新分类，并识别出标准病理学未能检出的排斥亚型。GeoMx等空间转录组平台可在保留组织结构的同时提供多重基因表达数据，揭示排斥过程中的免疫微环境。将分子数据与组织学及临床发现整合可提高诊断精度，支持个体化免疫抑制，减少对有创活检的依赖。这些微创、多组学方法有望提供前所未有的诊断灵敏度，并可能变革VCA中的排斥检测与管理。

新兴与辅助模式

新兴与辅助模式旨在弥补VCA中基于活检的排斥监测的局限。激光多普勒血流测定、红外热成像与吲哚菁绿（ICG）血管造影等成像技术可对浅表灌注与淋巴引流进行实时、无创评估。激光多普勒血流测定测量微血管血流，仍是浅表组织灌注的标准，但探测深度有限。红外热成像可识别早于临床症状的体温变化，在色素性皮肤中表现可靠，为活检提供无接触、客观的补充。ICG血管造影与近红外淋巴造影可可视化VCA中的淋巴引流与收缩功能，评估淋巴重建与功能障碍。这些方法不能替代活检，但可作为改善早期检测的辅助手段。血流MRI可量化血管流量与动脉直径，在结构性损伤前检出早期移植物血管病变，但主要反映血流动力学而非免疫变化，且无法区分排斥与感染或非免疫性损伤。循环生物标志物如dd-cfDNA在VCA排斥监测中也具潜力，其在肾、心、肺移植中已显示出高灵敏度与特异度，并已进入临床无创监测实践。数字病理与人工智能（AI）进一步强化组织学评估。在实体器官移植中，AI辅助切片分析可减少观察者间变异性，提高可重复性，并支持跨组织的模式识别。近期肾脏研究显示，深度学习模型可高精度量化纤维化与间质炎症等Banff特征，并区分临界病变与排斥。在VCA中，类似方法或可标准化Banff分级、协调多中心研究，并提供皮肤与黏膜病理的客观测量。综上，这些模式可通过微创、实时的灌注、微血管完整性与组织健康数据补充组织学，支持更早、更精准的干预。

迈向整合与无创诊断路径

VCA中急性排斥的高发率及对单纯皮肤活检的依赖，推动了侵入性更低、更全面的诊断策略的发展。一项系统综述在人与动物模型中确定了17种不同的无创或微创监测模式，涵盖无创血管成像、液体生物标志物、表皮采样、临床分级量表与示踪皮瓣，用于诊断或监测同种异体移植物排斥。血清与细胞生物标志物已显示出作为急性排斥诊断辅助工具的潜力。研究团队2019年的多中心研究显示，VCA重度排斥期间血清MMP3水平激增，但该早期研究的局限在于fVCA中缺乏黏膜活检，未能明确此类水平如何受其他组织排斥的影响。同样，一项针对3例面部移植受者的回顾性分析发现，排斥期间外周淋巴细胞亚群（CD3⁺/CD4⁺T细胞与CD16⁺/CD56⁺NK细胞）显著上调。另一项采用标准实验室检查（全血细胞计数及分类、C反应蛋白、基础代谢面板）的研究观察到，急性排斥发作期间C反应蛋白升高，这也在小动物模型中得到印证。一项使用CyTOF的研究在单细胞水平证实了排斥期间多种关键免疫细胞类型的上调，包括CD8⁺/GZMB⁺T细胞，其水平在皮肤与黏膜联合排斥期间显著激增。未来，这些诊断辅助手段可与常规组织学互补，帮助识别可提高诊断精度的分子或细胞模式，特别是考虑到多种皮肤病在组织学上可与排斥相似。然而，现阶段单纯无创监测仍不现实，因为这些方法均未经验证，甚至淋巴细胞群体的变化也不具排斥诊断特异性。实际上，在标准全血细胞计数中，排斥与非排斥发作期间的总白细胞与淋巴细胞计数并无显著差异。全身免疫变化的程度可能取决于移植物大小，较小的部分fVCA可能不会引发可测量的系统性改变。新型分子标志物最终或可补充组织学评估，例如类似于肾脏移植诊断中探索的Banff人类器官移植（B-HOT）基因面板的转录组谱分析。然而，由于VCA病例数有限，皮肤（+fVCA的黏膜）活检仍是常规临床中最常用的诊断方法。将血管受累评分纳入Banff分类是迈向更全面框架的进步，但排斥的生物学机制尚未完全阐明。未来，移植中心间的标准化与协作对于统一诊断路径、完善早期检测与预防慢性排斥的管理策略至关重要。详细分析配对皮肤与黏膜活检数据（针对fVCA）是重要的第一步。领先中心通过登记系统、汇总数据分析与开放交流协作验证并实施新型诊断工具，将加速其向常规实践的转化，并改善早期排斥检测与长期移植物结局。

讨论

随着诊断技术超越组织学范畴，将这些模式整合入统一框架需要实用的工作流程，以连接基于组织的与无创的数据流。常规皮肤与黏膜活检可继续作为组织学分级的锚点，而dd-cfDNA、血清细胞因子面板与转录组谱分析等并行检测可提供排斥活动的定量生物标志物。红外热成像与ICG血管造影等成像模式可提供即时的灌注功能评估，指导活检定位与纵向监测。将这些数据整合入标准化评分体系或机器学习流程，可支持跨中心的客观、可重复诊断，减少对单纯组织学的依赖。皮肤仍是VCA排斥诊断中最可及、验证最充分的组织，但并不总能反映更深或并行组织中的免疫损伤。黏膜排斥可独立于或重于皮肤排斥发生，意味着单纯皮肤活检可能遗漏关键的免疫事件。关于黏膜采样应取代还是补充皮肤活检用于常规监测仍存在争议。2022版Banff修订通过增加捕捉血管炎与慢性血管改变的血管修饰因子，解决了2007年框架的局限，但针对抗体介导与慢性排斥的标准化标准仍有限。推进VCA诊断需要集体努力：多中心协作、共享数据基础设施与统一标准，推动该领域从实验阶段走向标准化临床实践。增加黏膜活检与评估可能是全面评估面部同种异体移植物免疫活动的重要补充。