基于整合乳酸化修饰组学-孟德尔随机化分析，CD44和APP被确定为头颈鳞状细胞癌中代谢-免疫交互作用的关键因果治疗靶点

《Frontiers in Immunology》：Metabolic-immune crosstalk in head and neck squamous cell carcinoma: CD44 and APP identified as causal therapeutic targets via integrated lactylation-Mendelian randomization analysis

　　

背景：头颈鳞状细胞癌（HNSCC）患者预后仍然较差，迫切需要新的诊断标志物和治疗靶点。虽然代谢重编程和免疫微环境失调是驱动HNSCC进展的关键因素，但连接这些过程的关键因果分子机制尚不清楚。蛋白质翻译后修饰，特别是蛋白质乳酸化修饰，可能作为这种代谢-免疫“交互作用”的重要界面。方法：研究人员开发了一个整合乳酸化修饰组学、转录组学和孟德尔随机化（Mendelian Randomization， MR）的综合分析框架。对三个公开的转录组学队列（53例HNSCC vs. 53例对照）进行了差异表达分析，并将所得基因与系统性编译的2124个乳酸化相关基因集合取交集。随后，使用大规模遗传工具变量（来源于表达数量性状基因座数据）和HNSCC全基因组关联研究汇总统计数据，通过MR分析鉴定因果风险基因。候选基因的功能角色通过富集分析、基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis， GSVA）和免疫反卷积（CIBERSORT）进行探索。实验验证在独立的癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas， TCGA）数据集和HNSCC细胞系中通过实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）进行。结果：研究人员鉴定出212个乳酸化修饰相关差异表达基因。MR分析确定CD44和APP是HNSCC的遗传因果风险因素，这两个基因在患者组织中均显著过表达。功能分析显示，CD44高表达与mTOR信号通路和细胞外基质（Extracellular Matrix， ECM）-受体相互作用通路的激活相关，并与M0型巨噬细胞浸润呈正相关。相反，APP高表达与蛋白质分泌和ECM通路激活相关，并与M2型巨噬细胞丰度呈正相关。在独立的验证队列和细胞模型中均一致证实了CD44和APP在HNSCC中的显著上调。结论：通过开创性地在HNSCC中应用多组学因果推断方法，本研究将CD44和APP确定为疾病易感性和进展的遗传因果风险因素。这些基因将不同的代谢通路与特定的免疫细胞亚群联系起来，在HNSCC代谢-免疫交互网络中发挥中心枢纽作用。该工作为未来开发基于乳酸化修饰通路的生物标志物和靶向干预措施提供了重要的理论基础。

头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma， HNSCC）是全球第七大常见恶性肿瘤。尽管近年来针对HNSCC的多模式治疗策略已取得显著进展，但超过半数的患者仍会出现复发或转移，全球5年总生存率持续低于60%。在晚期疾病中，5年总生存率仅为50%左右。化疗和免疫治疗耐药也是导致HNSCC患者生存预后不良的重要原因。因此，揭示驱动HNSCC发生和进展的分子机制对于改善患者预后至关重要。肿瘤细胞即使在有氧条件下也优先进行糖酵解，这种代谢适应被称为Warburg效应，会导致大量乳酸产生。乳酸过去被认为是代谢副产物，现在被认识到是一种信号分子，可驱动肿瘤转移、血管生成和免疫抑制。在HNSCC中，乳酸促进癌症干性和I型胶原沉积。最近的一项突破性发现揭示，乳酸还可以作为新型蛋白质翻译后修饰——组蛋白赖氨酸乳酸化修饰的底物，从而直接将代谢状态与表观遗传基因调控联系起来。在HNSCC中，新兴证据表明，这种由乳酸驱动的表观遗传重编程可诱导CD8⁺ T细胞耗竭，提示高组蛋白乳酸化水平与次优免疫治疗反应之间存在机制联系。因此，鉴定HNSCC中与乳酸化修饰相关的靶点对于治疗开发具有重要的临床意义。尽管人类HNSCC的转录组学研究一致揭示了能量代谢和免疫特征的失调，但整合转录组学、乳酸化修饰组学和因果推断方法来定位因果调控因子的研究尚未在HNSCC中探索。传统的差异表达基因（differentially expressed genes， DEGs）分析本质上是关联性的，无法推断因果关系；而针对翻译后修饰（post-translational modifications， PTMs）的孤立研究往往缺乏强有力的遗传证据支持其临床意义。因此，两个关键问题阻碍了进一步的进展：哪些与乳酸化修饰相关的DEGs在增加HNSCC风险方面具有因果作用？这些基因通过什么机制双重介导代谢功能障碍和免疫微环境重塑？孟德尔随机化（Mendelian randomization， MR）提供了一种强大的方法来解决上述问题，它使用遗传变异作为工具变量（instrumental variables， IVs）进行因果推断。然而，在HNSCC研究中，乳酸化修饰组学、多队列转录组学和MR的联合使用尚未被探索。这一方法学空白严重限制了治疗策略的进步。本质上，有前景的HNSCC干预措施必须满足两个关键标准：它们应得到遗传因果证据的支持，并在代谢和免疫通路的交叉点发挥双重调控功能——这是任何单一组学方法都无法达到的。缺乏一个全面的整合框架，与乳酸化修饰相关的DEGs的诊断和治疗潜力就无法完全实现。为了解决这一缺陷，研究人员开发了一个整合分析框架，将乳酸化修饰与MR相结合。通过对三个HNSCC转录组学队列（共53例HNSCC样本和53例正常对照）进行分析，整合乳酸化修饰组学、DEGs筛选和MR，研究人员定位了具有因果联系的HNSCC风险基因，并通过实验证实了它们参与代谢-免疫失调和免疫微环境的动态调控。该研究开创性地将CD44和APP确定为与乳酸化修饰相关的HNSCC发病机制中的因果调节因子，从而为其诊断效用和治疗前景建立了理论基础。

研究人员开发了一个整合分析框架，主要采用了以下关键技术方法：首先，从GEO数据库收集了三个HNSCC转录组数据集（GSE6631， GSE13399， GSE58911），并进行了批次校正和差异表达分析，鉴定出1128个差异表达基因（DEGs）。其次，通过文献和数据库系统性地收集了2124个与乳酸化修饰相关的基因，并与DEGs取交集，得到212个乳酸化修饰相关DEGs。第三，利用来自eQTL数据库的大规模遗传工具变量（SNPs）和HNSCC的GWAS汇总统计数据（队列：1，106例病例，372，016例对照，均为欧洲血统），进行了孟德尔随机化（MR）分析，以鉴定因果风险基因。第四，利用STRING数据库构建了蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并使用Cytoscape进行可视化分析以识别枢纽基因。第五，采用了多种计算生物学方法进行功能分析和验证，包括GO/KEGG富集分析、基因集变异分析（GSVA）来探索通路活动，以及使用CIBERSORT和xCell算法进行免疫细胞浸润反卷积分析，使用ESTIMATE算法评估肿瘤微环境（TME）组成。最后，在独立的TCGA验证队列（515例肿瘤，44例非肿瘤）和HNSCC细胞系（CAL-27， TU177， FaDu）中，通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）对候选基因表达进行了实验验证。

3.1 数据整合与差异表达基因筛选：研究人员从GEO数据库获取了三个HNSCC转录组数据集，合并后构成包含53例HNSCC肿瘤组织和53例正常对照的队列。通过主成分分析（PCA）校正批次效应后，进行差异表达分析，鉴定出1128个显著差异表达基因（DEGs）。热图展示了前50个最显著DEGs的表达模式，显示出HNSCC与正常组织之间明显的转录组差异。
3.2 乳酸化修饰相关差异表达基因的鉴定：通过文献和数据库系统收集了2124个乳酸化修饰相关基因（LRGs），与1128个DEGs取交集，得到212个乳酸化修饰相关DEGs。经过MR分析，根据三个预设筛选标准，鉴定出CD44和APP是因果风险基因，它们在HNSCC患者中表达显著升高。因果关系通过MR核心结果（留一法敏感性分析图、遗传关联散点图、逆方差加权法估计值森林图）得到支持。诊断效用评估显示，CD44的ROC曲线下面积（AUC）为0.844，APP的AUC为0.697，表明两者均能有效区分HNSCC患者与健康个体。
3.3 PPI网络分析鉴定CD44和APP为核心枢纽节点：由212个乳酸化修饰相关DEGs构建的PPI网络包含大量相互连接的基因，涉及代谢和免疫调控。CD44和APP位于网络的中心位置，与多个功能重要的伙伴基因相互作用，包括与细胞外基质组织、糖酵解和免疫细胞浸润相关的基因，支持了它们作为HNSCC代谢-免疫交互作用核心调控枢纽的角色。
3.4 乳酸化修饰相关DEGs的功能富集分析：对212个基因进行GO和KEGG通路富集分析。GO分析显示显著富集于前体代谢物和能量产生、有机化合物氧化能量衍生、细胞呼吸和嘌呤核苷酸代谢等生物过程。KEGG分析显示主要关联缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，碳水化合物和能量代谢，以及HIF-1信号通路。GSVA分析显示，CD44高表达组样本中mTOR信号通路、ECM-受体相互作用等通路显著激活；APP高表达组样本中蛋白质分泌、ECM-受体相互作用、核黄素代谢等通路显著激活。值得注意的是，ECM-受体相互作用通路在CD44和APP高表达组中均显著上调。
3.5 HNSCC免疫细胞浸润评估：使用CIBERSORT算法表征HNSCC肿瘤微环境中的免疫细胞景观，并分析基因表达与免疫浸润的关联。结果显示，HNSCC组织中M0型巨噬细胞、M1型巨噬细胞和活化肥大细胞比例显著升高，而初始B细胞、初始CD4⁺ T细胞、滤泡辅助T细胞、单核细胞和静息肥大细胞比例显著降低。Spearman相关性分析进一步显示，CD44表达与M0型巨噬细胞浸润呈正相关，与初始B细胞呈负相关；APP表达与M2型巨噬细胞丰度呈正相关，与调节性T细胞（Tregs）和记忆B细胞呈负相关。使用xCell算法的交叉验证进一步证实了这些免疫细胞关联。
3.6 与CD44和APP表达相关的肿瘤微环境特征：使用ESTIMATE算法进一步分析枢纽基因表达与整体肿瘤微环境组成的关系。与低表达组相比，CD44高表达患者间质评分显著更高，免疫评分显著更低，肿瘤纯度无显著差异。同样，APP高表达与显著升高的间质评分和显著降低的肿瘤纯度相关，免疫评分组间无显著差异。这些结果表明CD44和APP的上调与HNSCC微环境中增强的间质浸润密切相关，并对免疫评分和肿瘤纯度产生不同影响。
3.7 CD44和APP的预后价值：使用TCGA-HNSCC队列进行生存分析。Kaplan-Meier生存曲线显示，CD44高表达与HNSCC患者较差的总生存期（overall survival， OS）显著相关（风险比（hazard ratio， HR）= 1.56， P = 0.005）；APP高表达同样与较差的OS显著相关（HR = 1.33， P = 0.036）。此外，分析显示CD44高表达与较短的无进展生存期（progression-free survival， PFS）显著相关（HR = 1.53， P = 0.013），APP高表达也与较差的PFS相关（HR = 1.34， P = 0.043）。这些结果表明CD44和APP均可作为HNSCC的独立预后生物标志物。
3.8 验证队列中的差异分析：分析整合校正后的GEO数据集（53对HNSCC-正常配对）发现，CD44和APP在HNSCC样本中的表达相对于正常对照显著升高。为了独立验证这些结果，研究人员使用TCGA数据集（515例肿瘤 vs. 44例正常组织）进行了外部验证。一致地，CD44和APP在HNSCC组织中均显著上调（P < 0.05），强化了它们表达异常并可能参与HNSCC发病机制的证据。
3.9 枢纽基因表达的实验验证：使用qRT-PCR和蛋白质印迹法验证关键基因CD44和APP的表达水平。与正常口腔角质形成细胞系HOK相比，所有三种HNSCC细胞系（CAL-27， FaDu， Tu177）在转录（mRNA）和翻译（蛋白质）水平上均表现出显著更高的CD44和APP表达。这些实验结果证实了生物信息学分析中观察到的表达模式。

在讨论部分，研究人员指出，本研究开发并实施了一种结合乳酸化修饰组学、转录组学和MR的新型整合分析框架，以识别HNSCC中代谢-免疫对话的因果调控因子。通过系统性地鉴定出212个与乳酸化修饰相关的DEGs，并随后使用广泛的遗传工具变量进行MR分析，提供了首个遗传因果证据，表明CD44和APP是HNSCC的风险基因，这得到了其显著诊断性能的支持。CD44表现出优异的区分能力（AUC = 0.844），而APP表现出中等的诊断性能（AUC = 0.697）。该研究超越了传统转录组学研究的关联性本质，并通过群体水平的遗传验证补充了专注于PTMs的研究。整合基因组学、转录组学和PTMs数据为精确定位具有因果关联和多功能性的治疗靶点提供了一个强有力的方法学蓝图，例如它们共同调节代谢和免疫通路的能力。CD44是已知的透明质酸受体和癌症干细胞标志物，与HNSCC的不良预后相关。本研究的MR分析提供了支持其因果作用的遗传证据，将关联提升到了因果推断的水平。功能分析从系统层面丰富了对CD44如何促进肿瘤发生的机制理解。在代谢和微环境层面，GSVA显示CD44高表达与mTOR信号通路、ECM-受体相互作用和粘着斑通路的显著激活密切相关。这些发现共同描绘了一个多层面的促肿瘤网络：CD44通过增强肿瘤-ECM粘附直接促进侵袭，同时mTOR激活作为糖酵解（Warburg效应）和蛋白质合成的主调节器。这种协同作用可能导致肿瘤微环境中乳酸大量积累，而乳酸是蛋白质乳酸化修饰的基本底物。因此，CD44似乎通过mTOR轴主动调控一个富含乳酸的代谢生态位，以促进其自身的促肿瘤功能并调节免疫活性。在免疫调节方面，相关性分析揭示了一个关键洞见：CD44表达与M0型巨噬细胞丰度呈显著正相关。这提示CD44主要参与肿瘤相关巨噬细胞的募集和初始动员。鉴于其同时激活mTOR信号，研究人员假设CD44高表达的肿瘤细胞可能通过分泌特定的趋化因子（如CCL2）或代谢物（如乳酸）促进单核细胞/巨噬细胞募集到肿瘤生态位，随后塑造其分化，从而在免疫抑制性微环境形成的早期阶段发挥关键影响。淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein， APP）在HNSCC发病机制中的具体机制贡献仍不完全清楚。虽然早期的生物信息学研究已将APP确定为HNSCC的候选关键基因，但本研究首次通过MR提供了群体水平的因果遗传证据。GSVA将APP高表达与蛋白质分泌、ECM-受体相互作用和核黄素代谢等激活通路相关联，表明APP高表达的肿瘤细胞可能擅长重塑其微环境。在免疫方面，相关性分析明确显示APP表达与M2型巨噬细胞浸润呈正相关。CD44和APP之间的相互作用揭示了时空和功能上的协同效应：CD44似乎主要在侵袭性肿瘤边缘发挥作用，通过mTOR-ECM通路推动代谢重编程和基质重塑，同时募集和启动像M0型巨噬细胞这样的髓系细胞。相反，APP可能在肿瘤核心或适应性应激下发挥作用，通过特化的代谢和分泌活动促进细胞存活，并与富含M2型巨噬细胞的免疫抑制、促纤维化生态位相关。它们的互补作用汇聚于关键的应激和代谢调节器，特别是HIF-1α。与免疫浸润发现一致，ESTIMATE算法进一步显示CD44和APP的高表达与更富间质的肿瘤微环境相关。具体而言，CD44过表达与显著升高的间质评分和显著降低的免疫评分相关，而APP上调与升高的间质评分和降低的肿瘤纯度相关。这些数据表明两者都可能促进HNSCC中更具纤维增生性、纤维化的微环境，这种微环境已知会限制免疫细胞浸润并导致免疫抑制。CD44和APP在免疫评分和肿瘤纯度上表现出不同的模式，表明它们可能对肿瘤微环境重塑产生不同的影响。综上所述，这些结果强化了CD44和APP作为肿瘤微环境关键调节因子的作用，支持了它们作为HNSCC生物标志物和治疗靶点的潜力。本研究结果将CD44和APP定位为连接HNSCC代谢异常和免疫失调的关键因果枢纽，提出了不同的转化意义：诊断和预后生物标志物潜力、通过分阶段干预进行靶向治疗的潜力以及上游代谢靶向策略。研究也承认了一些局限性，包括多源数据整合的潜在技术混淆因素、体内直接分子相互作用证据的缺乏，以及临床转化和泛化性（如未按HNSCC亚部位分层、主要使用欧洲血统GWAS数据）有待解决的问题。

研究结论部分指出，研究人员建立了一个整合乳酸化修饰组学、转录组学和MR的综合分析框架，并开创性地将其应用于发现HNSCC中的因果驱动因素。利用这种方法，研究人员将CD44和APP定位为该恶性肿瘤的因果风险基因。随后的系统层面研究描绘了CD44和APP作为代谢-免疫交互作用的中心调节因子，汇聚于肿瘤微环境中代谢重编程和免疫功能障碍的界面，并与HNSCC进展相关。总之，这项工作基于因果推断，为HNSCC发病机制提供了更深入、系统层面的理解，并为未来开发靶向乳酸化修饰轴及相互关联的代谢-免疫网络的生物标志物和治疗方法奠定了关键的理论基础。