《Frontiers in Oncology》：Synergistic anticancer effect of ellagic acid and Kaempferol combination in a mouse model of breast cancer
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背景：癌症仍然是一个重大的全球健康问题，是主要的死亡原因之一。乳腺癌是全球最常见的肿瘤之一。天然产物在癌症治疗中展现出显著优势。鞣花酸（Ellagic acid, EA）是一种源自天然的多酚类化合物，具有强大的抗癌特性。山奈酚（Kaempferol, KAE）
背景：癌症仍然是一个重大的全球健康问题，是主要的死亡原因之一。乳腺癌是全球最常见的肿瘤之一。天然产物在癌症治疗中展现出显著优势。鞣花酸（Ellagic acid, EA）是一种源自天然的多酚类化合物，具有强大的抗癌特性。山奈酚（Kaempferol, KAE）是一种已知具有强效抗癌活性的天然物质。本研究探讨了EA与KAE联合使用对多种癌细胞系的抗肿瘤活性。方法：体外实验中，研究人员利用MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化铵）测定法评估了EA、KAE及其组合对五种癌细胞系（MDA-MB-231、T47-D、HeLa、EMT-6/P、A549）以及非癌细胞系Vero的抗增殖活性。对T47-D细胞进行EA、KAE及两者联合处理后，测量了caspase-3活性。体内研究中，将EMT-6/P细胞注射到Balb/C小鼠体内，然后用EA、KAE及其组合进行治疗。测量肿瘤大小和重量，并对所有治疗组进行了肝毒性和肾毒性评估。结果：体外实验显示，EA与KAE的组合在所有测试的癌细胞系中均发挥了协同抗增殖作用，其中对T47-D细胞的作用最为显著。该组合对非癌细胞系Vero的毒性较低。此外，与单一药物治疗相比，组合治疗诱导了更强的细胞凋亡（apoptosis）。体内实验中，EA与KAE组合显著减少了肿瘤体积（p< 0.05），并增加了无瘤小鼠的比例。安全性评估显示，组合治疗组未出现肝脏或肾脏毒性迹象（p > 0.05）。结论：由于其协同效应，EA与KAE的组合是乳腺癌治疗的一种有前景的候选方案。它通过诱导细胞凋亡，最大限度地发挥了治疗潜力。
癌症是由多种生理和生化过程改变引起的复杂疾病。近几十年来的研究表明，标准抗癌药物可导致癌细胞产生多药耐药（MDR），进而引起肿瘤复发。乳腺癌仍是全球女性面临的最严重的癌症相关健康问题，在全球范围内约每20人中有1人患病，在富裕国家这一比例高达每8人中有1人。超过80%的癌症相关死亡是由于MDR的发展，这促使研究人员寻找新的解决方法。一种有前景的策略是靶向癌细胞中的多个通路，以降低耐药性并改善治疗效果，同时保持较低的副作用。天然物质价格实惠、易于获取，并可能通过其独特的生物学效应提供稳定的抗MDR新药来源。当组合使用并产生协同作用时，它们有潜力改善治疗效果并提高患者生存率。在本研究中，研究人员聚焦于两种著名的天然活性物质EA和KAE，两者单独使用时均已被证实具有抗癌活性。然而，在本研究之前，它们的联合效应尚未被探讨。研究人员评估了EA、KAE及其组合在体外条件下对包括EMT-6/P、MDA-MB-231、T47-D、HeLa和A549在内的多种癌细胞系的影响。此外，研究人员还使用植入了EMT-6/P乳腺癌细胞系的雌性Balb/C小鼠进行了体内实验。研究结果发现，所有治疗组，尤其是联合疗法，在体外和体内模型中均显著抑制了癌细胞的增殖和肿瘤生长。本研究设计中未纳入标准的化学治疗剂，因为其主要焦点是评估EA和KAE单独及联合使用的直接细胞毒性活性，并探究它们之间的相互作用。因此，与传统化疗药物的比较不在本探索性研究的预期范围内。其目的是表征这些天然化合物的潜在协同效应，而非直接与已确立的疗法进行比较。将来有必要进行纳入标准化疗药物（如阿霉素或多西他赛）的研究，以进一步评估相对疗效。基于当前发现，EA、KAE及其组合降低了所有测试癌细胞系的细胞活力。鉴于体外观察到一致的抗增殖效应，研究人员随后采用体内乳腺癌小鼠模型进一步评估抗肿瘤活性。在该模型中，治疗与肿瘤大小的减小以及治疗后肿瘤消退的动物比例增加相关。体外结果显示，单独使用EA治疗在EMT-6/P、T47-D、MDA-MB-231、HeLa和A549细胞系中均呈现出剂量依赖性抑制效应。随着EA浓度的增加，细胞活力持续下降。这些结果与先前报道EA抗癌活性的研究一致。特别是，EA已被证明通过靶向MDA-MB-231细胞中的CDK6信号传导来抑制细胞周期进程。同样，在本研究中发现EA以剂量依赖性方式抑制了A549肺癌细胞的生长。这些发现与早期研究结果一致，后者证明EA通过在体外条件下显著减少ATP产生、破坏线粒体膜电位并降低氧气消耗来抑制肺癌细胞增殖。研究人员检测了EA对HeLa癌细胞的抑制作用，结果与早期研究一致，后者报道EA以剂量依赖性方式抑制HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，先前研究表明EA在HeLa细胞中诱导G1期细胞周期阻滞并促进凋亡。总之，这些观察结果支持了EA在多种癌细胞类型中抗增殖活性的一致性。在本研究中，EA和KAE单独使用时对T47-D乳腺癌细胞系显示出最强的抗增殖作用，其半数抑制浓度（IC50）值分别为11 μM和16 μM。相比之下，两种化合物对Vero细胞均表现出有限的细胞毒性，IC50值均大于100 μM。虽然这些发现表明对非癌细胞的毒性较低，但Vero细胞在本研究中用作非癌细胞系对照，以提供一般细胞毒性的初步评估。然而，由于它们来源于非人类肾脏组织，不能完全代表正常乳腺上皮生物学特性，因此有必要使用组织相关性更强的正常乳腺细胞模型进行进一步研究。单独使用KAE进行的实验显示，其对MDA-MB-231细胞的增殖具有抑制作用，这与先前表明KAE主要通过线粒体依赖性途径在MDA-MB-231细胞中诱导凋亡的研究一致。本研究中观察到的T47-D细胞对KAE的高度敏感性也与早期发现相符。相比之下，KAE对A549肺癌细胞的抑制作用略有减弱。关于HeLa细胞，本研究显示随着KAE剂量的增加，存活率下降，这与早期研究一致，后者表明KAE通过PI3K/AKT和端粒酶信号通路促进HeLa细胞凋亡，并且其降低细胞活力的作用取决于剂量和暴露时间。当EA和KAE单独测试时，其IC50值通常大于100 μM，表明每种化合物单独使用时细胞毒性较低。有趣的是，当EA和KAE联合使用时，与单独治疗相比，IC50值显著降低。在联合治疗后，所有测试的癌细胞系中均观察到明显的剂量依赖性抑制。IC50值的这种降低表明两种化合物之间存在显著的协同相互作用。联合治疗组IC50值的显著下降使得可靠计算联合指数（combination index, CI）值成为可能。这些发现表明观察到的协同效应并非源于高单药毒性，而是两种化合物联合使用时疗效增强。因此，基于联合IC50值的CI计算为EA和KAE之间的药理学相互作用提供了有意义的见解。在测试的细胞系中，Vero细胞对治疗的抵抗力最高，其次是HeLa和MDA-MB-231细胞。相比之下，T47-D细胞表现出最高的敏感性，EMT-6/P细胞也显示出显著的反应性。具体而言，在T47-D细胞中，联合治疗中EA的IC50值为0.59 μM，KAE的IC50值为0.23 μM。CI值表明EA-KAE组合对EMT-6/P、A549和T47-D细胞系具有强协同作用，对HeLa和MDA-MB-231细胞系具有中度协同作用，而对Vero细胞系则表现出拮抗作用。这些发现表明，EA和KAE的共同给药比单独使用任何一种化合物更能增强抗癌活性。重要的是，组合治疗中达到IC50所需的有效浓度远低于单独应用所需的浓度。然而，组合实验采用固定剂量设计进行，即一种化合物维持在恒定浓度，而另一种化合物则在浓度范围内进行测试。虽然这种方法适用于药物相互作用的初步筛选，但并未完全表征整个剂量反应面或多种固定比例下的相互作用。此外，CI值仅在单一效应水平（Fa = 0.5）进行评估。因此，观察到的协同相互作用应被视为初步结果，并且仅限于测试的条件。需要更全面的分析，包括跨越多个效应水平的完整矩阵设计和基于等效线图的评估，以更精确地定义EA和KAE之间的相互作用特征。本研究中通过测量单一乳腺癌细胞系（T47-D）中的caspase-3活性来评估凋亡，使用的浓度是相对于IC50值选择的。EA和KAE单独使用均能增加caspase-3活性，表明它们在T47-D细胞中具有诱导凋亡的能力。与本研究的发现一致，已有研究证明鞣花酸通过线粒体功能障碍和活性氧（ROS）积累在癌症干细胞样细胞中诱导DNA损伤并促进凋亡，进一步支持了EA的促凋亡活性。一项最近的系统综述也进一步支持了这些发现，该综述强调了山奈酚在多种体外癌细胞系中一致的促凋亡作用，加强了其在诱导程序性细胞死亡中的机制作用。有趣的是，当两种化合物一起使用时，caspase-3活性的增加甚至比单独使用任何一种都更为显著。这表明EA和KAE的组合可能在通过凋亡途径促进细胞死亡方面具有协同效应。这些发现与先前的研究一致，后者也报道了用这些化合物治疗多种癌细胞系后caspase-3激活和凋亡增强。尽管有这些观察结果，本研究中的凋亡分析受限于仅使用一种细胞系、单一治疗浓度和单一的生化指标。此外，未进行肿瘤组织内凋亡特征的组织病理学确认。虽然caspase-3激活提供了凋亡的支持性证据，但它无法全面表征所涉及的分子机制，也无法完全捕捉凋亡反应的复杂性或剂量依赖性。其他检测方法，如Annexin V/PI染色、PARP（聚ADP核糖聚合酶）裂解分析，或在多种浓度和细胞系中进行评估，将提供更全面的凋亡评估，并加强机制解释。因此，在未来的研究中应考虑这些方法，以进一步阐明涉及的凋亡途径。总体研究结果支持EA和KAE之间的协同相互作用，这反映在CI值低于1以及联合治疗中多种细胞系的IC50值降低上。这与在T47-D细胞中观察到的caspase-3活性增加一致。然而，鉴于凋亡是使用单一标志物在一个细胞系中评估的，这些发现仍然有限。体内结果显示，以50 mg/kg/天的剂量治疗EA导致肿瘤大小减少了3.54%，并在20%的治疗小鼠中观察到完全的肿瘤消退。这些结果与早期显示EA在不同肿瘤模型中体内抗癌作用的研究一致。在一项研究中，患有MDA-MB-231乳腺癌异种移植物的雌性裸鼠每天接受EA注射（50或100 mg/kg）持续25天。两种剂量均减小了肿瘤体积，较高剂量的效果更大，表明存在剂量依赖性反应。EA还减少了VEGFR-2信号传导，这表明它破坏了肿瘤血管生成。这些体内结果与早期的体外和计算机模拟研究一致，后者表明EA可以直接作用于VEGFR-2并阻断帮助肿瘤生长和形成新血管的途径。EA有潜力限制肿瘤进展和新生血管形成，这两者对肿瘤存活和转移至关重要。相比之下，以25 mg/kg/天的剂量给药的KAE并未导致最终肿瘤体积相对于初始测量值的减少。然而，与对照组相比，肿瘤进展明显减缓。具体而言，KAE治疗小鼠的肿瘤体积增加了27.46%，而对照组在同一时期内增加了90.24%。这表明，在选定的剂量和治疗持续时间内，KAE发挥了延缓肿瘤生长的作用，而非诱导消退。在一项早期研究中，使用瑞士白化小鼠的Ehrlich腹水癌（EAC）模型，以25 mg/kg/天和50 mg/kg/天的剂量腹腔注射（IP）给予山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（KAE的糖苷衍生物），较低剂量使EAC活细胞减少了约37.2 ± 7.9%，较高剂量减少了70.9 ± 6.6%，显示出强烈的剂量依赖性效应，该治疗也诱导了肿瘤细胞凋亡。他们使用的山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷比KAE水溶性更好，因为糖基（α-L-鼠李糖）含有能与水良好相互作用的极性羟基（-OH），这可能提高了生物利用度。没有糖基的KAE疏水性更强，不易溶解。其他研究也表明，KAE可以通过涉及凋亡诱导和氧化应激调节的机制在体内抑制肿瘤生长。此外，在使用Balb/C裸鼠膀胱癌异种移植物模型的体内研究中，这些小鼠每天腹腔注射50至150 mg/kg的KAE，持续31天，治疗显著抑制了肿瘤生长。综上所述，这些报告表明，可能需要更高的剂量、改进的剂型或更长的治疗周期才能使KAE单独使用产生更显著的抗肿瘤效果。在本研究中，研究人员评估了EA（50 mg/kg/天）和KAE（25 mg/kg/天）在体内的联合效应，以确定它们的共同给药是否能产生协同的抗癌反应。据研究人员所知，此前没有体内研究探讨过EA和KAE联合用于抗癌。研究结果显示，该组合产生了显著的协同效应。肿瘤体积减少了56.71%，并在40%的治疗小鼠中观察到完全的肿瘤消退。在治疗期结束时从不同实验组解剖获得的代表性肿瘤图像进一步支持了测量到的肿瘤体积和消退率的差异，尤其是在联合治疗组。这些结果显著优于任一化合物单独使用的效果。这种增强的活性与本研究的体外发现一致，即联合治疗产生了更低的IC50值和协同的相互作用谱。所有小鼠在肿瘤建立后均被随机分配到治疗组。肿瘤测量使用卡尺按照标准化方案进行；然而，在治疗给药或肿瘤测量期间未实施盲法，这是本研究的一个局限性。在研究期间，未在治疗小鼠中观察到与治疗相关的并发症、行为变化或意外死亡，这表明在该实验条件下该组合具有良好的耐受性。在体内观察到的EA-KAE组合增强的抗肿瘤活性与体外鉴定的协同效应一致。然而，有几个局限性应予以承认。未对肿瘤组织进行组织病理学评估，也未评估诸如Ki-67、TUNEL和裂解caspase-3等机制生物标志物。因此，对增殖抑制和凋亡诱导的体内确认仍然有限。此外，腹腔内给药方案是基于先前发表的类似化合物临床前研究选择的，但未进行药代动力学分析。鉴于已知EA和KAE的生物利用度有限，缺乏药代动力学分析可能影响对这些发现的转化解释。总体而言，EA和KAE的组合在本临床前模型中显示出比单一药物治疗更强的抗肿瘤活性。尽管如此，结果应谨慎解释。未来的研究应纳入组织病理学验证、机制生物标志物分析、药代动力学表征、替代给药策略、盲法结果评估、扩展的剂量范围、更长的治疗持续时间和全面的毒理学评估，以更充分地定义这种组合的治疗潜力。在研究任何药物的治疗潜力时，尤其是那些用于癌症治疗的药物，毒性和整体安全性的评估是首要关注点。由于药物主要通过肝脏和肾脏代谢和排泄，测量这些器官的酶提供了关于潜在毒性效应的重要线索。测量了血清ALT和AST水平以研究肝功能，而血清肌酐水平则用作肾功能的参数。将治疗动物的结果与未植入任何肿瘤的正常小鼠的结果进行了比较，作为正常肝脏和肾功能的参考。在本研究中，研究人员发现治疗小鼠与健康小鼠之间的血清肌酐水平没有显著差异，这表明EA、KAE或其组合未对肾功能产生不利影响。这与先前的研究一致，表明KAE可以保护肾脏免受多柔比星（阿霉素）造成的损伤，同时不降低其在乳腺癌中的抗癌作用。同样，EA已被证明在实验模型中可以减轻顺铂引起的肾损伤。有趣的是，与健康小鼠相比，未治疗的荷瘤小鼠血清肌酐水平较低。这种降低可能归因于癌症诱导的恶病质，这种状况在动物模型和人类癌症患者中均常见，导致进行性肌肉流失。由于肌酐是肌肉代谢的副产物，肌肉质量减少会导致肌酐产生减少。此外，全身炎症（恶病质的一个关键特征）也与血清肌酐水平降低有关。关于肝功能，与健康小鼠相比，所有治疗组血清ALT水平无显著差异，这表明所给予的治疗未对肝功能产生有害影响。虽然KAE治疗组和联合治疗组的AST水平与健康对照组相比无显著差异，但在EA治疗组检测到显著升高。在没有相应ALT升高的情况下，这种变化不太可能表明存在真正的肝细胞损伤。大量文献支持这一解释，这些文献显示鞣花酸在多种肝损伤实验模型（包括酒精诱导的肝损伤）中不具有肝毒性，反而表现出肝保护特性。同样重要的是要注意，AST不是肝脏特异性酶，广泛分布于其他组织，如心脏、骨骼肌、肾脏、脑和红细胞。因此，AST的升高可能源自非肝脏来源。包括操作相关压力、肌肉劳损、炎症、物理损伤或采样相关的溶血等因素都可能导致观察到的升高，而非直接的肝毒性。在这种情况下，对肝损伤更具特异性的ALT通常保持在正常范围内。与此解释一致，在KAE治疗组或接受EA-KAE组合的小鼠中未检测到AST或ALT水平的显著改变。此外，有报道称山奈酚在实验研究中对肝损伤具有保护作用。总之，这些发现表明，在实验条件下，EA和KAE的联合给药未诱导可检测到的肝脏或肾脏毒性。尽管统计分析主要基于p值，但整体生化谱支持以下结论：观察到的抗肿瘤效应并未伴随明显的全身毒性。然而，未来需要更大规模的队列研究、扩展的生物化学检测组和组织病理学确认，以更全面地定义这些治疗的安全性特征。EA和KAE的组合在包括EMT-6/P、T47-D、HeLa、A549和MDA-MB-231在内的不同癌细胞系中显示出协同的抗肿瘤作用。此外，与单一治疗相比，它通过增加caspase-3激活显著增强了细胞凋亡，在测试浓度下提供了增强凋亡信号传导的生化证据。在使用植入了EMT-6/P乳腺癌细胞的Balb/C小鼠动物模型中，EA和KAE组合导致了肿瘤大小的减小和更高比例的无瘤动物。血清生化标志物评估表明，在实验条件下，联合治疗组未出现明显的肾毒性证据，也未出现一致的肝毒性迹象。总之，这些发现支持EA和KAE作为互补剂，在临床前体外和体内模型中具有增强的抗癌活性潜力。虽然这些早期结果很有希望，但需要更多研究来充分了解这种组合的作用机制及其在癌症治疗中的应用方式。
