《Animal Research and One Health》：ZBED6 Knockout Promotes Skeletal Muscle Development in Bama Pigs by Relieving Transcriptional Repression of CDKN1A
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摘要：骨骼肌发育不仅决定家畜的生长性能和肉品质，还与人类代谢健康密切相关。ZBED6已被鉴定为IGF2(胰岛素样生长因子2)的转录抑制因子，但其在骨骼肌发育中的作用及分子机制尚不清楚。本研究利用ZBED6敲除(Knockout, KO)巴马猪模型，发现ZBED
摘要：骨骼肌发育不仅决定家畜的生长性能和肉品质，还与人类代谢健康密切相关。ZBED6已被鉴定为IGF2(胰岛素样生长因子2)的转录抑制因子，但其在骨骼肌发育中的作用及分子机制尚不清楚。本研究利用ZBED6敲除(Knockout, KO)巴马猪模型，发现ZBED6缺失导致肌肉质量增加和肌纤维肥大，表明ZBED6在肌肉生长中起抑制作用。为进一步阐明潜在机制，研究人员整合转录组学和功能分析探究ZBED6–CDKN1A轴。通过对8月龄KO与野生型(Wild-Type, WT)猪7个组织的RNA测序(RNA Sequencing, RNA-seq)鉴定差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)，加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA)揭示一个富集肌生成通路的骨骼肌特异性模块。将该模块与5月龄和8月龄背最长肌(Longissimus Dorsi, LD)转录组数据及染色质免疫沉淀测序(Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-seq)数据整合后，鉴定CDKN1A为核心枢纽基因(Hub Gene)。双荧光素酶报告基因检测证实ZBED6结合猪和小鼠CDKN1A启动子区保守GCTCG基序并抑制其转录。一致地，在C2C12细胞中，ZBED6干扰(shRNA/siRNA knockdown)上调成肌标志物(MyoD、MyoG和MyHC)表达并促进肌管形成，而沉默CDKN1A减弱该效应；反之，ZBED6过表达降低CDKN1A表达并抑制分化，证实其双向调控作用。综上，研究人员确定CDKN1A是ZBED6的转录靶基因，ZBED6通过抑制CDKN1A约束骨骼肌发育。
论文解读：
《Animal Research and One Health》发表的此项研究围绕ZBED6(Zinc Finger BED-Type Containing 6)在猪骨骼肌发育中的转录调控机制展开。已有研究表明ZBED6是IGF2的转录抑制因子且ZBED6敲除可促进猪和小鼠肌肉生长，但其下游调控网络特别是除IGF2外的直接靶基因及机制尚未阐明。CDKN1A(p21, Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1A)作为细胞周期抑制因子参与成肌分化调控，但是否受ZBED6调控及其在ZBED6敲除促肌生成中的作用未知。为此研究人员利用CRISPR/Cas9构建的ZBED6 KO巴马猪，联合多组织转录组、WGCNA、ChIP-seq筛选枢纽基因，并在细胞水平验证ZBED6–CDKN1A轴的调控功能与成肌分化效应。
主要关键技术方法：使用前期制备的ZBED6 KO与野生型(WT)巴马猪为样本队列，采集8月龄个体7个组织(背最长肌LD、腓肠肌GM、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)及5月龄个体LD组织进行RNA-seq；以8月龄7组织Top 5000变异基因做WGCNA筛选骨骼肌特异模块；整合模块基因、5月龄和8月龄LD的DEGs及猪骨骼肌ChIP-seq鉴定的ZBED6靶基因取交集筛选枢纽基因；qPCR验证基因表达，双荧光素酶报告实验检测ZBED6对CDKN1A启动子的转录抑制；C2C12成肌细胞进行ZBED6和CDKN1A的单敲/共敲/过表达，Western blot和MyHC免疫荧光评估成肌分化。
3 Results
3.1 ZBED6 KO Enhanced Muscle Fiber Area and Modulated Transcriptional Expression in Pigs
H&E染色显示ZBED6 KO猪背最长肌肌纤维横截面积增大；8月龄7组织RNA-seq经PCA可明显按组织分型，LD与GM表达模式相近；各组织鉴定到15–347个DEGs，其中LD有116个DEGs(62上调、54下调)，GM有95个DEGs(62上调、33下调)；LD中DEGs显著富集肌肉组织发育等GO条目，GM中DEGs富集肌肉系统过程等条目，提示ZBED6缺失影响骨骼肌发育相关生物学过程；随机选4个DEGs经qPCR验证与RNA-seq趋势一致。
3.2 Specific Modules Related to Muscle Growth in ZBED6 KO Pigs
WGCNA软阈值β=8构建共表达网络，鉴定到与骨骼肌(LD、GM)显著正相关的蓝绿色(Turquoise)模块(含1155个注释基因和155个新基因)，该模块显著富集肌发生相关GO条目及KEGG通路；STRING蛋白互作网络显示经典成肌调节因子IGF2、MSTN、MYOD1、MYOG位于高度互联的中心；模块成员(MM)>0.8且基因显著性(GS)>0.2筛选枢纽基因，Turquoise模块与WT及KO猪LD表达均显著相关，其中有6个基因上调、12个基因下调。
3.3 Identification and Characteristics of DEGs in LD of 5-month-Old WT and ZBED6 KO Pigs
5月龄LD RNA-seq质控合格，PCA可区分WT与KO组；鉴定1506个DEGs(760下调、746上调)，显著富集肌肉组织发育、代谢及细胞分化GO条目，KEGG富集AMPK信号通路和FoxO信号通路。
3.4 Hub Genes Related to Muscle Development in ZBED6 KO Pigs
将5月龄LD-DEGs、8月龄LD-DEGs、Turquoise模块基因及ChIP-seq鉴定的ZBED6靶基因取交集，获得4个共同基因：IGF2、CDKN1A、ENHO、ROS1；其中IGF2和CDKN1A在猪C2C12 ChIP-seq中有直接ZBED6结合峰且在5月和8月LD中一致上调(CDKN1A在5月约1.9倍、8月约2.3倍上调，qPCR验证一致)；猪ChIP-seq显示ZBED6结合CDKN1A启动子区染色体7约启动子下游781 bp处含保守GCTCG基序；双荧光素酶报告实验显示含野生型GCTCG基序的猪和小鼠CDKN1A启动子荧光素酶活性显著低于突变(AAAAA替代)型，证明ZBED6结合保守GCTCG基序抑制CDKN1A转录。
3.5 ZBED6 Regulates Myoblast Differentiation Through CDKN1A
C2C12细胞中si-ZBED6使ZBED6蛋白降低、CDKN1A蛋白升高，上调MyoD、MyoG、MyHC mRNA并促进MyHC阳性肌管形成；共转si-CDKN1A可抵消si-ZBED6引起的CDKN1A升高及成肌标志物的上调，并减少肌管形成。过表达ZBED6降低CDKN1A并使成肌标志物下调、肌管形成受抑，共过表达CDKN1A可部分回补该抑制效应。表明ZBED6至少部分通过CDKN1A调控成肌分化。
讨论与结论：
既往已知ZBED6通过抑制IGF2调控肌肉生长，本研究进一步发现ZBED6直接结合CDKN1A启动子保守GCTCG基序并转录抑制CDKN1A，解除该抑制后CDKN1A上调促进成肌分化与肌纤维肥大，从而扩展ZBED6调控网络。WGCNA鉴定的骨骼肌特异模块含已知成肌调节因子及CDKN1A、IGF2等枢纽节点。CDKN1A在成肌过程中具阶段依赖性双重作用——早期促使细胞周期退出限制增殖、后期维持终末分化状态，与本研究中ZBED6敲除致CDKN1A升高伴随分化增强相符。此外5月龄LD DEGs富集AMPK与FoxO通路提示ZBED6可能存在多层次调控。局限性在于本研究未在猪原代成肌细胞及体内蛋白水平验证CDKN1A变化。未来需探讨CDKN1A阶段特异性功能、ZBED6与其他转录因子互作及在猪原代成肌细胞中验证。
结论：研究人员鉴定CDKN1A为ZBED6新的直接转录靶基因；ZBED6通过与猪和小鼠CDKN1A启动子区保守GCTCG基序结合抑制其转录，ZBED6基因敲除解除对该抑制使CDKN1A表达升高，进而促进成肌标志物表达及肌管形成，最终促进巴马猪骨骼肌发育与肌纤维肥大。
