《International Journal for Parasitology》：First continuous in vitro culture of Plasmodium coatneyi reveals insights into barriers to human infection
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Plasmodium coatneyi 是重症疟疾研究中的重要模型，因为其具有类似恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的血液滞留（sequestration）特征，但相关研究长期受限于缺乏体外培养系统。近期，来自马来西亚存档样本的分子证据提
Plasmodium coatneyi 是重症疟疾研究中的重要模型，因为其具有类似恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的血液滞留（sequestration）特征，但相关研究长期受限于缺乏体外培养系统。近期，来自马来西亚存档样本的分子证据提示在人类中存在 P. coatneyi 感染（在已鉴定的猿猴疟疾中占 3.5%，即 85 例中的 3 例），提示其具有人畜共患潜力。研究人员报告了 P. coatneyi 的首个连续体外培养体系，并利用双颜色流式细胞术（flow cytometry）检测其人畜共患潜力。通过使用 CellTracker Deep Red（CTDR）标记靶细胞，研究人员定量分析了其在不同灵长类物种间的入侵情况，并揭示出潜在的样本特异性可塑性。研究在食蟹猴（Macaca fascicularis）红细胞中建立了稳健的连续培养体系，培养时间超过 40 d，冻存复苏后寄生虫血症（parasitaemia）可达 3%。尽管 P. coatneyi 能够成功入侵人红细胞，但其无性期发育在入侵后发生阻滞，至第 9 天寄生虫血症降至检测下限以下。显微镜分析进一步证实，该寄生虫无法在人红细胞中完成 48 h 发育周期，从而提示存在阻碍持续性人畜共患传播的潜在生物学屏障。最终，该培养方案提供了一个可持续的体外平台，可用于功能性研究，尤其适用于重症疟疾病理发生研究，以及对人畜共患疟原虫宿主广嗜性（host promiscuity）的监测。
该文发表于《International Journal for Parasitology》。研究聚焦于猴疟原虫 Plasmodium coatneyi 的体外培养体系建立及其跨宿主感染能力评估。P. coatneyi 长期以来被视为研究重症疟疾，尤其是脑型疟（cerebral malaria）的关键实验模型，其感染红细胞可表现出与恶性疟原虫相似的黏附性、硬化及微血管滞留特征，并可在脑、心、肾等重要器官血管内皮发生细胞黏附，进而导致严重病理损伤。因此，该虫种不仅对阐明恶性疟原虫样致病机制具有重要价值，也与灵长类疟原虫的人畜共患传播风险密切相关。
然而，当前该领域存在两个核心瓶颈。其一，缺乏可靠的定量方法评价 P. coatneyi 在不同宿主红细胞之间的跨种入侵能力。传统显微镜观察虽可在共孵育后看到环状体（ring form），但难以明确区分真正进入异源靶红细胞的入侵事件与供体接种物中残留同源红细胞发生的再感染。由于 P. coatneyi 感染红细胞常与未感染红细胞形成簇集，供体裂殖子接种物中混入较高比例未感染供体红细胞，这一问题尤其突出。其二，缺乏可长期维持的连续体外培养系统，使得深入机制研究、遗传操作、药物筛选及宿主限制因素分析均受到限制。正是在这一背景下，研究人员开展本项研究，旨在同时突破跨种入侵定量检测和长期培养两个长期未解的问题。
研究人员首先建立并验证了一种基于 CellTracker Deep Red（CTDR）的双颜色流式细胞术（flow cytometry）入侵检测体系。该方法将外源靶红细胞预先荧光标记，使其能够与未标记供体红细胞明确区分，同时结合 Hoechst 33342 对寄生虫 DNA 进行染色，从而在同一实验体系中同时识别同源再感染与异源入侵。借助这一平台，研究人员定量测定了 P. coatneyi 对不同灵长类红细胞的入侵能力，并进一步据此探索其最适培养细胞环境，最终首次建立了 P. coatneyi 的连续体外培养体系。研究显示，P. coatneyi 可入侵人红细胞，但无法在其中完成后续无性增殖周期；相反，在食蟹猴红细胞中可实现超过 40 d 的稳定连续培养，冻存复苏后仍可恢复并达到 3% 的寄生虫血症。由此，研究提出人红细胞中存在入侵后发育屏障，这是限制其持续性人类感染的重要生物学基础。该成果的重要意义在于：一方面为 P. coatneyi 的功能学、转录组学、全基因组及遗传修饰研究提供了可持续实验平台；另一方面为理解灵长类疟原虫跨宿主传播的宿主限制机制提供了直接证据，也有助于减少对非人灵长类感染模型的依赖。
主要技术方法方面，研究人员使用在泰国 AFRIMS 通过脾切除恒河猴（Macaca mulatta）连续传代维持的 P. coatneyi（Hackeri 株），于感染后采集血期寄生虫并体外成熟至裂殖体（schizont），再经磁分选（MACS）富集。针对跨种入侵评估，采用 CTDR 预标记人及猕猴来源靶红细胞，联合 Hoechst 33342 染色后进行双颜色流式细胞术定量分析，并以吉姆萨染色薄血膜显微镜进行形态学验证。连续培养则在食蟹猴、恒河猴及人红细胞中分别尝试建立，持续监测寄生虫血症变化；人网织红细胞（reticulocyte）来源于脐带血富集样本，人正常红细胞来自健康成人供者，日本多种猕猴红细胞来自无疟动物设施。
在结果部分，论文首先以“3.1. Development of a quantitative flow cytometry assay for cross-species Invasion”为题，说明研究人员建立了用于跨物种红细胞入侵分析的定量流式细胞术体系。初步显微镜观察显示，来自恒河猴供体的 P. coatneyi 裂殖体在与人正常红细胞和富集人网织红细胞共孵育 24 h 后可见环状体，提示其可能能够入侵人红细胞。然而，这一传统方法无法排除供体接种物中残留恒河猴红细胞被再次感染的可能性，因此无法准确判断真正的异种入侵。为解决这一问题，研究人员采用 CTDR 预标记外源靶红细胞，并通过流式细胞术将细胞分为四个象限：Q1 为未标记感染供体细胞，即同源再感染；Q2 为 CTDR 阳性且感染的靶细胞，即异源入侵；Q3 为 CTDR 阳性未感染靶细胞；Q4 为未标记未感染供体细胞。该体系显著提高了分辨率和可重复性，消除了显微镜法固有的不确定性，为后续宿主偏好和长期培养分析奠定了技术基础。
在“3.2. Invasion and host cell preference plasticity”部分，研究人员利用上述流式体系分析了来自 3 只供体恒河猴、但处于相同实验条件下的 3 份 P. coatneyi Hackeri 株样本。结果显示，不同样本在 24 h 内均可入侵所有测试靶红细胞群体，但入侵效率和宿主细胞偏好存在差异，提示该寄生虫表现出一定程度的表型可塑性。总体上，寄生虫对人正常红细胞的入侵和生长显著低于对恒河猴红细胞，但其确实能够进入人红细胞。这一发现构成了 P. coatneyi 存在跨物种传播潜力的首个定量证据，也说明仅仅具备入侵能力并不能等同于建立稳定感染。
在“3.3. Establishment of the first continuous P. coatneyi culture”部分，研究人员进一步测试不同红细胞环境是否支持持续增殖，从而建立首个连续培养系统。研究选取 R338 和 R745 两份样本开展长期培养。R338 在恒河猴红细胞中的寄生虫血症持续下降，并于第 16 天低于检测限；在食蟹猴红细胞中虽一度于第 9 天升至 2.1%，但随后仍下降并在第 26 至 39 天不可检出。相比之下，R745 在食蟹猴红细胞中的培养更为成功，寄生虫血症在第 24 天前下降，之后逐渐回升，至第 40 天达到 2%。而且，第 22 天冻存保存的培养物在复苏后重新接种至新鲜培养体系，前 14 天维持稳定，至第 33 天寄生虫血症升至 3%，证明该体系不仅可持续培养，而且具备良好冻存复苏兼容性。吉姆萨染色证实培养体系内可见典型环状体、滋养体（trophozoite）和成熟裂殖体，提示其无性血期发育完整。由于采用静置培养体系，单个红细胞内可见双环及三裂殖体等多重感染现象。
同一部分还显示，人红细胞环境并不支持持续培养。R338 接种于富集人网织红细胞后，寄生虫血症迅速下降并于第 9 天降至不可检测。对应血片分析表明，新入侵人红细胞的寄生虫无法完成完整 48 h 发育周期，因此不能产生下一轮裂殖子并再次入侵。进一步显微镜观察显示，在 24 h 观察时段内，人红细胞中未见晚期感染阶段，说明障碍并非仅在入侵阶段，而是主要位于入侵后的胞内无性发育过程。该结果直接揭示了人红细胞中存在限制 P. coatneyi 持续复制的关键屏障。
随后，研究人员利用“Fig. 5”所对应的分析，对经 40 d 体外适应后的培养虫株进行了再评估，以检验宿主偏好是否会因长期培养而改变。结果表明，来自 R745 的培养适应虫株在食蟹猴红细胞中维持了原有偏好，仍显著优先入侵猕猴红细胞，而对人红细胞及日本猕猴（Macaca fuscata）红细胞的偏好较低。更重要的是，在人红细胞中虽可观察到早期环状体，但未见晚期环状体或早期滋养体进一步发展；而在食蟹猴红细胞中则可见后续阶段寄生虫形态。这表明，长期体外培养并未消除其宿主偏好特征，也再次支持 P. coatneyi 对人红细胞存在入侵后发育阻滞这一结论。
在讨论部分，论文强调，本研究首次实现了 P. coatneyi 的连续体外培养，这是猴源且可能具有人畜共患潜力的疟原虫研究中的重要进展。连续培养体系的建立，使研究人员能够在标准实验室条件下获得可持续寄生虫材料，为后续全基因组测序、转录组分析、克隆株建立及基因修饰研究创造了条件，并有望减少对实验性非人灵长类感染模型的依赖。研究同时指出，双颜色流式细胞术平台不仅解决了传统显微镜无法区分同源再感染和异源入侵的难题，也揭示了 Hackeri 株不同供体来源样本之间存在表型差异，包括红细胞选择性及体外适应成功率的不同。这一现象提示同一虫株内部可能存在遗传异质性，或红细胞环境可快速塑造入侵表型。
关于人类感染屏障，论文认为最重要的认识在于：P. coatneyi 具备入侵人红细胞的能力，但这种能力并不足以支持持续感染，因为其在入侵后无法顺利完成红细胞内发育周期。研究人员指出，这一现象可能与人和猕猴红细胞之间的代谢环境差异、营养物质利用限制或膜转运差异有关，但原文也明确强调这些机制目前仍属推测，尚待进一步验证。论文还结合既往马来西亚人群样本中检测到的 P. coatneyi DNA 证据指出，P. coatneyi 应被视为“潜在”人畜共患疟原虫，而非已经完全确立的人体疟原虫；因为仅凭分子检测仍需谨慎解释，特别是在混合模板嵌套 PCR 中存在伪嵌合扩增风险。尽管如此，本研究的人红细胞入侵数据与自然条件下低水平、显微镜难以检出的感染现象是相一致的。
研究结论部分可译为：总之，研究人员首次建立了 P. coatneyi 的连续体外培养体系，这一成果是疟疾研究的重要进展。尽管 P. coatneyi 表现出可测量的人红细胞入侵能力，但其无法完成红细胞内发育周期，揭示了阻碍持续复制的潜在入侵后屏障。在实践层面，P. coatneyi 培养体系的获得将减少对实验性感染非人灵长类模型的需求。这为构建 P. coatneyi 克隆系、获取全基因组序列、开展转录组学分析并最终建立遗传修饰虫系开辟了道路，也使得研究人员能够启动对其分子机制的详细比较功能研究，从而阐明其在猕猴中所表现出的类似恶性疟原虫的重症疟疾病理过程，包括脑型疟的发生机制。
