德拉沙星(Delafloxacin)抑制DEPDC1(Dishevelled, Egl-10, and Pleckstrin domains containing 1)表达并诱导非小细胞肺癌细胞G2/M期阻滞：一项药物重定位(Drug Repurposing)研究

《Smart Molecules》：Delafloxacin suppresses DEPDC1 expression and induces G2/M arrest in non-small cell lung cancer cells: A drug repurposing study

： 越来越多的证据强调DEPDC1(Dishevelled, Egl-10, and Pleckstrin domains containing 1)基因在肺癌进展中的致癌作用，使其成为极具吸引力的治疗靶点。本研究探讨了氟喹诺酮类抗生素德拉沙星(Delafloxacin)在DEPDC1过表达的非小细胞肺癌NCI-H1299细胞中的抗癌潜力。研究人员利用AutoDock Vina对1399种FDA批准化合物进行计算机(In silico)对接，确认德拉沙星与DEPDC1活性位点具有较强的结合亲和力(结合能Binding Energy ?7.1 kcal/mol)。德拉沙星处理导致细胞增殖呈剂量依赖性抑制，IC50约为30 μg/mL。RT-qPCR显示DEPDC1及多个关键调控因子显著下调，包括增殖相关基因(RAS, EGFR)、有丝分裂进程基因(周期蛋白依赖性激酶1(CDK1), CCNB2, KIF2C)和存活基因(BIRC5)。细胞周期分析表明德拉沙星处理后引起G2/M期富集，与CDK1和CCNB2的转录抑制相一致。在体内实验中，德拉沙星给药(15 mg/kg)显著抑制裸鼠移植瘤模型中的肿瘤生长且无明显毒性。尽管这些发现确定德拉沙星为肺癌重定位的候选药物，但观察到的DEPDC1下调属于相关性发现而非已验证的直接靶向作用。本研究为进一步研究德拉沙星在DEPDC1相关恶性肿瘤中的应用提供了理论基础。

论文解读：

本文发表于《Smart Molecules》。非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)确诊时常处于晚期，预后极差，且存在耐药和远处转移问题，亟需寻找新的治疗靶点和策略。DEPDC1(Dishevelled, Egl-10, and Pleckstrin domains containing 1)是癌症-睾丸抗原(Cancer-Testis Antigen)，在肝癌、膀胱癌及NSCLC等多种肿瘤中高表达，在正常组织中几乎不表达（除睾丸外），其高表达与NSCLC患者总生存期较差相关，可通过激活NF-κB等信号通路促进细胞周期进展及上皮-间质转化，被认为是潜在的NSCLC治疗靶点和诊断生物标志物。药物重定位(Drug Repurposing)可缩短新药研发周期、降低成本。本研究旨在通过计算机虚拟筛选结合体外体内实验，探究FDA批准的氟喹诺酮类抗生素德拉沙星(Delafloxacin)是否可通过靶向DEPDC1发挥抗NSCLC作用。

研究人员采用的主要关键技术方法如下：利用AutoDock Vina对ZINC数据库中1399种FDA批准药物与DEPDC1蛋白(PDB ID: 2YSR)进行分子对接(Molecular Docking)虚拟筛选；使用Molinspiration平台预测候选化合物的ADMET性质及类药性(Lipinski's Rule of Five)；选用DEPDC1高表达的NCI-H1299人NSCLC细胞系进行CCK-8法检测细胞活力并计算IC₅₀；通过RT-qPCR检测DEPDC1及相关下游基因(如RAS, EGFR, CDK1, CCNB2, KIF2C, BIRC5等)的mRNA表达量；采用碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色结合流式细胞术(Flow Cytometry)分析细胞周期分布；建立BALB/c裸鼠NCI-H1299细胞异种移植瘤(Xenograft)模型，静脉给予德拉沙星(15 mg/kg)评估体内抑瘤效应及体重变化。

3 RESULTS AND DISCUSSION

3.1 Structural characterization of the DEPDC1 binding pocket

研究人员对DEPDC1的DEP结构域(PDB ID: 2YSR)进行结构分析，确认配体结合口袋由芳香族(TRP, PHE, MET)、极性(ARG, ASN)及疏水(VAL, LEU, ALA)残基组成，经MMFF94X力场能量最小化后作为分子对接的高保真模板。结论：鉴定出DEPDC1功能性结合口袋，为后续对接提供结构基础。

3.2 Virtual screening and molecular docking analysis

研究人员对1399种FDA批准化合物进行分子对接，按结合能(Binding Affinity)排序，结合能越低代表结合越强。德拉沙星结合能为?7.1 kcal/mol，在筛选库中表现优异（仅次于核黄素Riboflavin ?7.2 kcal/mol，优于阿法替尼Afatinib ?6.8 kcal/mol、莫西沙星Moxifloxacin ?6.8 kcal/mol、环丙沙星Ciprofloxacin ?6.7 kcal/mol）。结论：德拉沙星与DEPDC1活性位点具有强预测结合亲和力，被选为候选分子进行实验验证。

3.3 Top candidate selection and binding interaction analysis

研究人员可视化分析德拉沙星、核黄素及阿法替尼与DEPDC1结合口袋的相互作用，发现德拉沙星与PHE、ASN等关键残基形成氢键及疏水相互作用（键距约3.7 ?），占据同一结合口袋。结论：德拉沙星在空间和化学性质上与DEPDC1 DEP结构域兼容，支持对接预测结果。

3.4 Drug-likeness assessment using Lipinski's rule of five

研究人员评估前15名候选分子的类药性，德拉沙星(MW 440.76 Da, miLogP ?0.70, H-bond donors 4, H-bond acceptors 8, 0个违例)和阿法替尼满足Lipinski五规则，核黄素虽结合最强但因极性表面积过大可能影响膜通透性。结论：德拉沙星兼具强结合亲和力和良好类药性，适合作为重定位候选药物。

3.5 In vitro growth inhibition of lung cancer cells

研究人员用CCK-8法检测德拉沙星、核黄素、阿法替尼对NCI-H1299细胞的剂量依赖性抑制，德拉沙星IC₅₀约30 μg/mL（~68 μM），最高浓度(128 μg/mL)下细胞活力降至10%以下，抑制能力强于核黄素(~30%残留)和阿法替尼(~40%残留)。结论：德拉沙星在体外对非小细胞肺癌细胞具有最强的抗增殖/细胞毒活性。

3.6 Delafloxacin downregulates DEPDC1 and the downstream signaling pathway

研究人员用RT-qPCR检测10、20、40 μg/mL德拉沙星处理24 h后11个基因的转录水平。DEPDC1、KIF2C、CDK1(Cyclin-Dependent Kinase 1)、CCNB2、RAS、EGFR、MAPK1、BIRC5(Survivin)、TNFSF12、FN1、NID1均呈剂量依赖性显著下调(p < 0.0001)，其中DEPDC1、KIF2C、CDK1下调幅度最大。结论：德拉沙星处理与非小细胞肺癌细胞中DEPDC1及增殖、有丝分裂、存活、基质重塑相关基因的共同转录抑制相关，提示其具有多通路抗癌活性，但DEPDC1下调是直接作用还是细胞周期阻滞的间接后果尚待验证。

3.7 DEPDC1 inhibition arrests cells in the G2/M phase

研究人员通过PI染色流式细胞术分析细胞周期。对照组G1/S/G2M分别为42.86%/42.03%/12.00%；10 μg/mL德拉沙星组G2/M升至17.61%，S期降至26.45%；20 μg/mL组G2/M进一步升至32.43%，S相降至23.17%，并伴有亚G1峰出现。结论：德拉沙星诱导NCI-H1299细胞发生浓度依赖性G2/M期阻滞，与RT-qPCR显示的CDK1和CCNB2（成熟促进因子MPF组分）转录抑制相符，提示G2/M检查点受阻。

3.8 In vivo anti-tumor efficacy of delafloxacin

研究人员建立NCI-H1299异种移植瘤模型，肿瘤体积达~175 mm³后随机分组，静脉给予德拉沙星15 mg/kg（每3天一次，共42天）。结果与对照组相比，给药组自第18天起肿瘤体积显著减小(p < 0.001)，终末瘤重显著降低(p < 0.0001)，且小鼠体重保持稳定、无肉眼毒性体征。结论：德拉沙星在体内显著抑制DEPDC1高表达NSCLC移植瘤生长且耐受性良好，但其抑瘤是否通过体内DEPDC1通路介导未做肿瘤组织药效学验证。

结论与讨论部分总结（翻译CONCLUSION）：

本研究确定FDA批准的抗生素德拉沙星可作为DEPDC1过表达肺癌药物重定位的候选分子。通过整合计算机筛选、体外实验及体内验证，证明德拉沙星抑制DEPDC1及下游增殖和有丝分裂进程调控因子(CDK1, CCNB2, KIF2C)的表达，导致NCI-H1299细胞G2/M期蓄积及裸鼠移植瘤生长受抑，首次提出氟喹诺酮类抗生素可能通过关联DEPDC1下调在非小细胞肺癌中发挥抗癌活性。需注意：(1)DEPDC1下调为相关性发现，需通过DEPDC1敲低/过表达模型及SPR、CETSA等生物物理方法验证直接结合；(2)需在蛋白水平(Western Blot检测CDK1, Cyclin B1, phospho-CDK1)及功能水平(phospho-Histone H3)确认G2或M期阻滞；(3)IC₅₀约30 μg/mL超过临床可达血药浓度，提示需结构优化或局部给药；(4)仅在NCI-H1299细胞中验证，需在A549、PC9等多NSCLC亚型中重复；(5)体内实验缺乏瘤组织药效学(IHC检测DEPDC1, Ki67, cleaved caspase-3)。尽管如此，本研究为基于DEPDC1靶点的fluoroquinolone骨架结构优化及DEPDC1相关恶性肿瘤的治疗探索提供了基础。