《Advanced Science》：Epigenetic Silencing of RFX7 Defines a Transcriptional Axis Linking Lactate Metabolism to Immune Checkpoint Therapy in Glioblastoma
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摘要：胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是一种高度侵袭性颅脑肿瘤，以快速增殖、弥漫浸润及强免疫抑制为特征。尽管已知过度有氧糖酵解及乳酸累积参与构建免疫抑制肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME），但GBM中连接代谢重
摘要：胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是一种高度侵袭性颅脑肿瘤，以快速增殖、弥漫浸润及强免疫抑制为特征。尽管已知过度有氧糖酵解及乳酸累积参与构建免疫抑制肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME），但GBM中连接代谢重编程与免疫治疗耐药的上游转录机制尚不清楚。研究人员通过整合转录组学、染色质免疫沉淀测序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-seq）及代谢分析并结合基因扰动实验，鉴定出由RFX7及其下游靶基因PIK3IP1构成的调控轴。GBM组织中RFX7因启动子区高甲基化而表达降低；恢复RFX7表达可上调PIK3IP1，抑制PI3K/AKT信号激活，并抑制GBM恶性进展。PIK3IP1缺失增加乳酸生成及组蛋白H4第12位赖氨酸乳酰化（Histone H4 Lysine 12 Lactylation, H4K12la），伴随程序性死亡配体1（Programmed Death-Ligand 1, PD-L1/CD274）及集落刺激因子1（Colony-Stimulating Factor 1, CSF1）上调及肿瘤免疫抑制特征增强。使用司替戊醇（Stiripentol）药理抑制乳酸生成可降低H4K12la水平、颅内肿瘤生长及免疫抑制细胞浸润，并在实验模型中改善生存及对免疫检查点治疗的响应。上述发现界定了GBM中连接乳酸代谢、组蛋白乳酰化与免疫抑制的上游转录通路，靶向RFX7–PIK3IP1轴为GBM免疫耐药中代谢–免疫调控机制提供了理论依据。
论文解读：胶质母细胞瘤中RFX7表观遗传沉默连接乳酸代谢与免疫检查点治疗的研究
本研究发表于《Advanced Science》。胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是中枢神经系统最具侵袭性的恶性肿瘤，患者中位生存期仅12–15个月。GBM的特征性免疫抑制肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）导致免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）疗效极差。GBM细胞常发生瓦博格效应（Warburg Effect），即有氧糖酵解增强致胞内及TME中乳酸大量堆积，乳酸不仅酸化微环境，还可通过组蛋白乳酰化（Histone Lactylation）这一新型表观遗传修饰调控基因转录，促进PD-L1等免疫抑制分子表达。然而，驱动GBM乳酸累积并协调其免疫抑制效应的上游转录调控因子尚未明确。调节因子X（Regulatory Factor X, RFX）家族转录因子参与肿瘤发生及免疫调节，其中RFX7在淋巴肿瘤中有抑癌作用且对自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞稳态至关重要，但其在GBM中的功能不明。本研究旨在探究RFX7是否及如何通过调控代谢–免疫轴影响GBM进展及ICB响应。
主要关键技术方法
研究人员联合TCGA（The Cancer Genome Atlas）与CGGA（Chinese Glioma Genome Atlas）低级别胶质瘤（Low-Grade Glioma, LGG）/GBM差异表达基因分析筛选候选基因，结合GBmap及CNP0003766单细胞转录组数据库定位细胞类型表达；收集唐都医院30例各等级胶质瘤石蜡标本及27例新鲜冰冻标本（含20例LGG、30例GBM）进行免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）、Western Blot（WB）、qPCR及亚硫酸氢盐焦磷酸测序（Bisulfite Pyrosequencing）检测启动子甲基化；构建RFX7过表达/敲低GBM细胞系（U251、T98G）及稳定转染PIK3IP1干预模型，行CCK8、EdU、克隆形成、Transwell及Annexin V凋亡检测；裸鼠及C57BL/6小鼠原位移植模型评估体内成瘤及生存；转录组测序（RNA-seq）与染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）交叉分析鉴定RFX7直接靶基因；非靶向代谢组学液相色谱–质谱（Liquid Chromatography–Mass Spectrometry, LC-MS）检测乳酸；Seahorse能量代谢分析仪测细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate, ECAR）；CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）检测H4K12la在全基因组富集；流式细胞术分析TME中细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocytes, CTLs/CD3+CD8+）、NK细胞、M1/M2肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）、调节性T细胞（Regulatory T Cells, Tregs/CD4+CD25+FoxP3+）及髓源抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs/CD11b+Gr1+）；使用去甲基化剂阿扎胞苷（Azacitidine, AZA）及乳酸生成抑制剂司替戊醇（Stiripentol）进行药物干预，并联合抗PD-1单抗或CSF1R抑制剂Pexidartinib评价联合疗效。
研究结果
2.1 RFX7 Expression is Downregulated in GBM via Promoter Hypermethylation（RFX7在GBM中因启动子高甲基化而下调）
生信筛选结合TCGA/CGGA数据分析显示RFX7在GBM及IDH野生型（IDH-wildtype）胶质瘤中显著低于LGG，且在单细胞数据中高表达于恶性GBM细胞。临床标本WB、qPCR、免疫荧光及IHC证实RFX7蛋白随胶质瘤级别升高而递减，高表达患者总生存更好。RFX7启动子CpG岛在GBM中甲基化水平显著升高，阿扎胞苷处理可逆转RFX7沉默。结论：GBM中RFX7启动子区异常高甲基化导致其转录抑制，低RFX7预示不良预后。
2.2 RFX7 Overexpression Inhibits GBM Cell Proliferation, Invasion, and Promotes Apoptosis（RFX7过表达抑制GBM细胞增殖、侵袭并促进凋亡）
腺病毒介导RFX7过表达降低U251/T98G细胞增殖（CCK8、EdU）、克隆形成及Transwell侵袭能力，增加凋亡比例；shRNA敲低RFX7则相反。原位移植裸鼠模型中，RFX7过表达组肿瘤体积减小、小鼠生存期延长，敲低组反之。结论：RFX7在体外及体内发挥抑癌功能，抑制GBM恶性表型。
2.3 RFX7 Modulates the PI3K/AKT Pathway by Transcriptional Regulation of PIK3IP1（RFX7通过转录调控PIK3IP1调节PI3K/AKT通路）
RNA-seq与ChIP-seq交集分析鉴定PIK3IP1为RFX7直接靶基因。双荧光素酶报告实验及ChIP-qPCR证实RFX7结合PIK3IP1启动子-1900至-1908 bp区激活其转录。RFX7过表达上调PIK3IP1、降低磷酸化PI3K（p-PI3K）及磷酸化AKT（p-AKT）；共沉默PIK3IP1可回补PI3K/AKT磷酸化。临床标本中PIK3IP1随胶质瘤级别下降且与RFX7正相关，高PIK3IP1患者生存较好。结论：RFX7直接转录激活PIK3IP1，抑制PI3K/AKT信号。
2.4 RFX7-PIK3IP1 Axis Regulates GBM Cell Proliferation, Invasion, and Tumorigenicity（RFX7–PIK3IP1轴调控GBM细胞增殖、侵袭及成瘤能力）
在RFX7过表达背景下共转染si-PIK3IP1，可部分逆转RFX7对增殖、克隆形成、侵袭的抑制及对凋亡的促进；体内共沉默PIK3IP1削弱RFX7过表达的抑瘤及延寿效应。结论：RFX7的抑癌作用部分依赖PIK3IP1介导。
2.5 Higher PIK3IP1 Expression Correlates with a Less Immunosuppressive TME Profile（高PIK3IP1表达与较低免疫抑制TME特征相关）
生物信息学分析及10例GBM患者转录组GO/GSEA显示PIK3IP1低表达组富集免疫响应负调通路，ESTIMATE/CIBERSORT提示低PIK3IP1组免疫/基质评分高、肿瘤纯度低、抑制性免疫细胞（Tregs、MDSCs、M2-TAMs）浸润增多、细胞毒免疫细胞（CD8+CTLs、NK、M1-TAMs）减少。GL261原位瘤过表达Pik3ip1小鼠模型中，流式细胞术验证CTLs、NKs、M1-TAMs浸润增加，Tregs、MDSCs、M2-TAMs减少。结论：PIK3IP1高表达关联抗肿瘤免疫微环境。
2.6 PIK3IP1 Silencing Regulates Lactate Accumulation and Activates Histone H4K12 Lactylation in GBM（PIK3IP1缺失调控乳酸累积并激活组蛋白H4K12乳酰化）
非靶向代谢组学及LC-MS显示PIK3IP1过表达降低胞内乳酸及ECAR。PIK3IP1缺失升高全局组蛋白乳酰化（pan-Kla），其中H4第12位赖氨酸乳酰化（H4K12la）变化最显著；CUT&Tag示PIK3IP1低时H4K12la在PTEN启动子区降低（PTEN下调）、在PD-L1（CD274）及CSF1启动子区富集（二者上调）。沉默写入酶P300可逆转PIK3IP1缺失引起的H4K12la升高及PD-L1/CSF1上调。Stiripentol抑制乳酸生成降低H4K12la、PD-L1、CSF1并恢复PTEN。结论：PIK3IP1缺失经PI3K/AKT→乳酸↑→P300介导H4K12la→PTEN↓/PD-L1↑/CSF1↑促免疫抑制。
2.7 Stiripentol Administration Reverses Tumor Malignancy and Alters Immune Cell Composition in GBM（Stiripentol给药逆转GBM肿瘤恶性表型并改变免疫细胞组成）
Stiripentol体外抵消si-PIK3IP1诱导的增殖侵袭增强；体内GL261-shPik3ip1模型经Stiripentol处理后瘤内乳酸降低、肿瘤生长受抑、小鼠生存期延长，且TME中CTLs、NKs、M1-TAMs增加，Tregs、MDSCs、M2-TAMs减少。Stiripentol联合抗PD-1抗体或CSF1R抑制剂Pexidartinib较单药进一步缩小肿瘤并延长生存。结论：抑制乳酸生成重塑免疫微环境并增敏ICB及CSF1R阻断疗效。
讨论与结论
研究人员在讨论中指出，GBM中RFX7因启动子高甲基化表观沉默，致其靶基因PIK3IP1转录下调，解除PIK3IP1对PI3K/AKT通路的抑制，促使有氧糖酵解增强及乳酸堆积；过量乳酸经P300催化H4K12la，在PTEN位点去乳酰化使其表达降低（进一步活化PI3K/AKT），而在PD-L1及CSF1基因启动子区添加H4K12la标记促其转录，协同募集Tregs、MDSCs及M2-TAMs，建立免疫抑制TME并削弱ICB响应。使用老药新用（Drug Repurposing）策略以Stiripentol抑制乳酸生成，可降低H4K12la、下调PD-L1/CSF1、恢复PTEN、抑制肿瘤生长并重塑TME，与抗PD-1或CSF1R抑制剂联用具协同增效。该工作阐明RFX7–PIK3IP1轴是连接转录调控、乳酸代谢及组蛋白乳酰化驱动免疫逃逸的上游枢纽，为GBM代谢–免疫联合治疗提供机制依据与新靶点。
研究结论翻译：
本研究整合患者数据与实验模型发现，GBM中RFX7的表观遗传沉默对应其下游靶基因PIK3IP1表达降低及PI3K/AKT信号激活，这些变化与乳酸生成增加及组蛋白H4K12乳酰化（H4K12la）相关，伴随PD-L1和CSF1上调及细胞毒免疫活性减弱，表明乳酸驱动的表观遗传修饰参与GBM免疫抑制。使用Stiripentol药理抑制乳酸生成可在实验条件下部分逆转上述分子及免疫改变，并增强免疫联合治疗效果。RFX7–PIK3IP1轴为理解GBM乳酸累积相关的免疫检查点耐药提供了上游转录调控机制框架。
