川陈皮素（Tangeretin）——枳壳（Citrus aurantium L.未成熟果实）中的一种生物活性多甲氧基黄酮——通过靶向巨噬细胞β2整合素Mac-1改善实验性结肠炎

《Journal of Ethnopharmacology》：Tangeretin, a bioactive polymethoxyflavone from immature Citrus aurantium L. fruit, ameliorates experimental colitis by targeting the macrophage β2 integrin Mac-1

　　

摘要：民族药理学相关性：枳壳（Zhiqiao）为酸橙（Citrus aurantium L.）的干燥未成熟果实，是广泛用于治疗胃肠疾病的传统中药。其中衢州产道地药材"衢枳壳（Quzhiqiao）"因品质优良备受推崇，但其治疗炎症性肠病（IBD）的药理基础尚不清楚。研究目的：本研究旨在DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎（UC）模型中，考察衢枳壳乙醇提取物（QZCEE）及其关键活性成分的治疗效应及分子机制，重点关注其对巨噬细胞驱动性炎症的影响。材料与方法：通过评估疾病活动指数（DAI）评分、结肠长度及组织学病理等临床与病理参数，评价口服QZCEE及其成分tangeretin对DSS诱导结肠炎小鼠的疗效；采用Western blot和qPCR检测肠屏障完整性；通过免疫组化（IHC）、ELISA和qPCR测定巨噬细胞浸润及结肠炎性反应；采用骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）在体外评估QZCEE和tangeretin对巨噬细胞黏附、迁移和趋化作用的影响；通过分子对接、pull-down、细胞热偏移实验（CETSA）、药物亲和响应靶稳定性（DARTS）实验及微量热泳（MST）鉴定并验证分子靶点；通过Western blot和Rac1活化实验探究下游信号通路。结果：口服QZCEE显著改善DSS诱导结肠炎严重程度，表现为DAI评分降低、结肠长度恢复及组织学损伤减轻；QZCEE还通过上调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达修复肠屏障。机制上，QZCEE明显抑制F4/80+巨噬细胞向炎症结肠浸润，并抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）产生。值得注意的是，QZCEE未降低结肠CCL2水平，但直接抑制巨噬细胞体外趋化。研究人员从QZCEE中鉴定出多甲氧基黄酮——川陈皮素（tangeretin）为该功效的关键活性成分，并提供证据表明tangeretin直接与β2整合素Mac-1（αMβ2）结合，解离常数（Kd）为3.87 μM，从而阻断Mac-1与ICAM-1相互作用并抑制下游Vav1/Rac1信号通路。重要的是，单独口服tangeretin在体内重现了QZCEE的治疗与免疫调节效应。结论：研究结果表明，道地药材衢枳壳（Quzhiqiao）对结肠炎具有显著治疗作用，该作用主要由其活性成分tangeretin介导——tangeretin是一种新型β2整合素Mac-1直接拮抗剂。通过阻断巨噬细胞招募，tangeretin有望成为开发UC靶向治疗的天然先导化合物。本研究为枳壳的民族药学应用提供了科学依据，并阐明其起效的精确分子机制。

论文解读：川陈皮素（Tangeretin）通过靶向巨噬细胞β2整合素Mac-1改善实验性结肠炎——发表于《Journal of Ethnopharmacology》

一、研究背景与立项依据

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种慢性特发性炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD），以结肠直肠黏膜反复发作为特征，全球发病率持续上升。现有疗法如5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂及抗TNF生物制剂存在应答不足、继发性失效及严重不良反应等局限，亟需发现更安全有效的新型治疗药物，特别是具有长期人类使用历史的天然产物。

枳壳（Zhiqiao），即酸橙（Citrus aurantium L.）未成熟干燥果实，是传统中医"理气""化瘀"治疗胃肠疾病的核心药物，其道地品种衢枳壳（Quzhiqiao，产自中国浙江衢州）临床口碑卓著，但现代药理学尤其是其抗UC的确切分子机制尚未阐明。

UC病理标志为大量先天免疫细胞——特别是巨噬细胞——浸润肠黏膜。单核细胞迁入后分化为活化巨噬细胞，释放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子加重损伤。巨噬细胞 firm adhesion与transendothelial migration高度依赖β2整合素Mac-1（CD11b/CD18，α_Mβ₂，即Macrophage-1 antigen或complement receptor 3, CR3），但迄今缺乏安全、特异的小分子Mac-1拮抗剂。研究人员假设衢枳壳乙醇提取物（QZCEE）可通过调控巨噬细胞驱动性炎症发挥抗结肠炎作用，并试图鉴定其关键活性成分及直接作用靶点。

二、主要关键技术方法概述

研究人员建立3% DSS诱导的C57BL/6小鼠急性结肠炎模型，设对照组、DSS模型组、阳性药柳氮磺吡啶（SASP）组、QZCEE低/高剂量组及tangeretin单体给药组，口服干预并监测体重、DAI及结肠长度。取结肠组织行H&E染色、IHC（F4/80）、Western blot与qPCR检测紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin）及炎性因子mRNA水平；分离骨髓诱导BMDMs进行Transwell趋化、黏附及迁移实验；采用分子对接预测tangeretin与Mac-1（α_MI-domain）结合模式，通过pull-down、CETSA（Cellular Thermal Shift Assay）、DARTS（Drug Affinity Responsive Target Stability）及MST（Microscale Thermophoresis，测定K_d值）验证直接结合；Western blot检测Mac-1下游Vav1及Rac1-GTP活化水平评估信号阻断效应。

三、研究结果

QZCEE Ameliorates Clinical and Pathological Manifestations of DSS-Induced Colitis in Mice（衢枳壳乙醇提取物改善DSS诱导小鼠结肠炎的临床与病理表现）

研究人员发现，与DSS模型组相比，QZCEE（低、高剂量）及SASP组小鼠体重下降幅度减小、DAI评分显著降低、结肠缩短被逆转，组织学显示上皮完整性改善、炎症细胞浸润减少，证实QZCEE口服对实验性UC具有明确治疗作用。

Intestinal Barrier Repair and Suppression of Macrophage Infiltration（肠屏障修复与巨噬细胞浸润抑制）

Western blot与qPCR结果显示QZCEE上调结肠组织紧密连接蛋白ZO-1与Occludin的蛋白及mRNA表达，提示肠屏障功能修复；IHC显示QZCEE显著降低炎症结肠F4/80⁺巨噬细胞密度，且qPCR表明促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平明显下降，但结肠组织CCL2（MCP-1）水平无明显变化，提示QZCEE非通过降低趋化因子浓度而是直接抑制巨噬细胞趋化行为。

Tangeretin Is the Key Bioactive Component and Directly Binds to Mac-1（川陈皮素为关键活性成分并直接结合Mac-1）

研究人员通过成分分析与体外BMDM趋化实验锁定多甲氧基黄酮——川陈皮素（tangeretin，纯度>95%）为QZCEE抑制巨噬细胞趋化的关键单体。分子对接提示tangeretin可与Mac-1的α_M亚基I-domain结合；pull-down及CETSA显示tangeretin处理使Mac-1蛋白热稳定性增加；DARTS实验证明tangeretin保护Mac-1不被蛋白酶降解；MST测定得tangeretin与Mac-1的K_d=3.87 μM。以上证实tangeretin是Mac-1的直接配体/拮抗剂。

Tangeretin Blocks Mac-1/ICAM-1 Interaction and Inhibits Downstream Vav1/Rac1 Signaling（川陈皮素阻断Mac-1与ICAM-1相互作用并抑制下游Vav1/Rac1信号）

功能实验表明tangeretin预处理BMDMs可剂量依赖性地削弱Mac-1介导的细胞与ICAM-1的黏附及趋化迁移；Western blot与G-LISA显示tangeretin抑制Mac-1激活后下游Vav1鸟苷酸交换因子相关活化及Rac1-GTP（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, GTP-bound active form）水平升高，证实其通过阻断Mac-1→Vav1→Rac1轴抑制巨噬细胞招募。

In Vivo Efficacy of Tangeretin Alone（单独给予川陈皮素的体内疗效）

单独灌胃tangeretin可重现QZCEE的全部治疗效果：降低DAI、恢复结肠长度、减轻组织损伤、上调ZO-1/Occludin、减少F4/80⁺巨噬细胞浸润及下调促炎因子，表明tangeretin是QZCEE抗结肠炎活性的主要介导成分。

四、讨论与结论翻译

讨论部分指出，本研究将枳壳传统"理气"功效转化为现代药理机制——即通过抑制巨噬细胞浸润改善结肠炎，不仅验证了衢枳壳抗UC疗效，还首次揭示其关键单体tangeretin作为天然Mac-1直接拮抗剂的崭新作用模式，弥补了小分子Mac-1拮抗剂研发中长期缺乏安全有效先导物的空白。

结论（翻译）：综上所述，本研究重新诠释了枳壳（Quzhiqiao）的民族药理学内涵。研究人员超越传统的"理气"概念，揭示其精确的现代药理学机制——通过抑制巨噬细胞招募改善结肠炎。研究人员鉴定出川陈皮素（tangeretin）不仅是又一种抗炎黄酮类化合物，而是β2整合素Mac-1的直接天然拮抗剂。本工作展示了民族药理学如何导向现代药物发现的范例，为衢枳壳的临床应用提供科学佐证，并为UC靶向治疗提供了新的天然先导化合物与作用靶点。