NMDA与甘氨酸受体对小脑浦肯野细胞攀缘纤维传入行使双重突触前调节功能

《Journal of Physiology》：NMDA and glycine receptors provide dual presynaptic regulation on climbing fibre inputs to cerebellar Purkinje cells

　　

摘要：突触前受体是中枢神经系统（CNS）活动的重要调节因子。研究人员利用振动分离的大鼠小脑浦肯野细胞（Purkinje cell, PC）标本检测了突触前受体群。在该标本中，NMDA受体免疫 Reactivity 与突触前标记物 synaptophysin 的抗体染色共定位。施加 NMDA 可增加抑制性和兴奋性突触电流的频率，该效应被 1 mM Mg2+阻断。单独施加高浓度甘氨酸（100 μM）也可引起类似的兴奋性输入刺激效应，该反应被 500 nM 士的宁（strychnine）阻断，但不被 1 mM Mg2+阻断。NMDA 和甘氨酸刺激均产生了幅值约 200–600 pA 的大幅度兴奋性突触后电流（excitatory postsynaptic current, EPSC）。这些事件的大小提示其源自攀缘纤维（climbing fibre, CF）而非平行纤维（parallel fibre, PF）连接。与此一致，最大幅值事件可被河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）稳定消除，且分离的浦肯野细胞对攀缘纤维标记物 peripherin 呈阳性染色。最后，研究人员在脑片标本中检测了 100 μM 甘氨酸的效应——与分离细胞结果相同，100 μM 甘氨酸刺激产生大幅度突触后电流且该效应被低浓度士的宁阻断。综上，本研究结果表明攀缘纤维上存在突触前 NMDA 受体和甘氨酸受体（glycine receptor, GlyR），二者均可作为攀缘纤维兴奋性递质（谷氨酸）释放的调节因子。

论文解读——《NMDA与甘氨酸受体对小脑浦肯野细胞攀缘纤维传入行使双重突触前调节功能》

本文发表于 The Journal of Physiology。既往研究表明，中枢神经系统多处存在突触前 NMDA 受体（N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR）及甘氨酸受体（glycine receptor, GlyR），可调节递质释放。在小脑，已有证据提示浦肯野细胞（Purkinje cell, PC）的抑制性传入（篮状/星状细胞末梢）及部分平行纤维（parallel fibre, PF）末梢存在突触前 NMDAR，可通过逆行信号介导去极化诱导抑制增强（depolarization-induced potentiation of inhibition, DPI）。然而，兴奋性攀缘纤维（climbing fibre, CF）—浦肯野细胞突触是否存在功能性突触前 NMDAR 或 GlyR 此前未见报道；此外，早期关于小脑突触前 GlyR 调控兴奋性传入的结论被认为可能源于远隔部位颗粒细胞的动作电位激活而非 CF 末梢本身。为明确 CF–PC 突触是否存在突触前 NMDAR 与 GlyR 并解析其功能，研究人员采用大鼠 P10 小脑振动分离神经元（nerve bouton / vibrodissociated preparation）及急性小脑矢状切片标本，结合全细胞膜片钳、免疫荧光共定位、FM1?43 突触囊泡染色及药理学手段展开研究。

主要关键技术方法

取出生后第10天（Postnatal day 10, P10）Sprague?Dawley 大鼠，制备小脑矢状切片后行振动分离获得保留活性突触末梢的孤立浦肯野细胞，同时制备 300 μm 急性小脑矢状切片。全细胞电压钳记录自发突触电流（spontaneous EPSC/IPSC, sEPSC/sIPSC），药理学干预包括 NMDA（含共激动剂 glycine 10 μM 或 D?serine 10 μM）、甘氨酸（100 μM）、MK?801、士的宁（strychnine, 500 nM）、TTX（100 nM）、DNQX、bicuculline 及 Mg²⁺（1 mM）。免疫荧光检测突触前标记 synaptophysin 与 GluN1 亚基、CF 标记 peripherin 与 PC 标记 calbindin 的共定位（Pearson 相关系数、Costes 随机化检验、Li's intensity correlation quotient, ICQ）。FM1?43 染色验证突触囊泡循环。事件检测采用 Mini Analysis 或 MATLAB 脚本，间期分布以最大似然法拟合双指数得加权时间常数（τ_{i w}），幅值分布差异用 Kolmogorov?Smirnov（KS）检验。

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Vibrodissociated Purkinje neurons retain both excitatory and inhibitory terminals（振动分离的浦肯野细胞保留兴奋性与抑制性末梢）

通过形态学、NMDA 无反应（确认无体树突 NMDAR）及 FM1?43 负载验证，分离 PC 保留功能性抑制性（GABA_A受体介导，被 bicuculline 阻断）与兴奋性（AMPA 受体介导，被 DNQX 阻断）突触末梢。结论：该标本适宜研究残存突触末梢上的突触前受体功能。

Mg²⁺?sensitive presynaptic NMDA receptors modify transmitter release in vibrodissociated Purkinje neurons（Mg²⁺敏感的突触前 NMDA 受体调节振动分离 PC 递质释放）

施加 NMDA（10–50 μM + 10 μM glycine 或 D?serine）显著提高总突触事件频率（τ_{i w}缩短），增加大振幅事件比例；免疫荧光显示 GluN1 与 synaptophysin 强共定位（中位 Pearson r = 0.839，P < 0.001；ICQ = 0.418）。效应被 1 mM Mg²⁺或 MK?801（10 μM）可逆性阻断；而 1 mM Mg²⁺不影响 4?AP（50 μM）诱发的频率升高。结论：PC 残存末梢存在功能性突触前离子型 NMDAR（Mg²⁺敏感），通过离子通道机制促进递质释放。

Presynaptic NMDA receptors regulate both inhibitory and excitatory connections（突触前 NMDA 受体调节抑制性与兴奋性连接）

分别在 DNQX 存在下（仅留 IPSCs）及 bicuculline 存在下（仅留 EPSCs）施加 NMDA。NMDA 增加抑制性 sIPSC 频率（被 bicuculline 消除，慢动力学），也增加兴奋性 sEPSC 频率（被 DNQX 消除，快动力学）及大事件比例（39/48 细胞有反应）。换用 D?serine 作共激动剂结果一致且被 MK?801 或 Mg²⁺阻断。结论：突触前 NMDAR 同时存在于抑制性中间神经元末梢及 CF（或 PF）兴奋性末梢，可上调两类传入的递质释放。

Glycine receptors also regulate release from excitatory terminals（甘氨酸受体亦调节兴奋性末梢递质释放）

100 μM glycine 单独应用显著提高 sEPSC 频率与大振幅事件比例（13/14 细胞），被 DNQX 取消；500 nM strychnine 显著减弱此效应（P = 0.0078），1 mM Mg²⁺无影响（P = 0.412）。结论：兴奋性末梢（主要为 CF）存在功能性突触前 GlyR，介导 glycine 诱导的释放增强，非 NMDAR 参与。

Climbing fibre fragments remain attached to vibrodissociated neurons（攀缘纤维片段附着于振动分离的浦肯野细胞）

calbindin? PC 胞体/残干可见 peripherin? 绳状结构，证实 CF 残段保留。单 PF EPSC 通常 < 30 pA，而 NMDA/glycine 诱发大量 200–600 pA 事件，远超 PF 预期，符合 CF 特征。结论：大振幅事件来源于附着的 CF 残段。

Action potentials generate the largest amplitude events stimulated by glycine and NMDA（甘氨酸与 NMDA 刺激产生的最大振幅事件由动作电位驱动）

NMDA 或 100 μM glycine 诱发的频率升高及大事件（> 100 pA）被 TTX（100 nM）显著抑制或消失（大事件完全消失），TTX 存在时仍可见小事件频率略升。NMDA/glycine 同时增加小（≤ 100 pA）与大（> 100 pA）事件数。结论：CF 末梢/残段上的 NMDAR 与 GlyR 去极化可激活电压门控 Na? 通道引发动作电位，从而产生 CF 特征性大幅度同步释放；在无 TTX 时亦可经 Ca2? 通道或局部 Ca2? 升高促进释放。

Slice recording confirms the glycine regulation of sEPSCs seen in vibrodissociated neurons（脑片记录证实振动分离标本所见甘氨酸调节 sEPSC 现象）

小脑切片 PC 全细胞记录中，100 μM glycine 诱发 > 100 pA 大 sEPSC（11/12 细胞），被 500 nM strychnine 显著减少（4/5 细胞），不影响基线小 EPSC。结论：完整小脑结构中 CF 末梢也存在突触前 GlyR，可易化谷氨酸能传递。

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讨论与结论总结

研究人员发现攀缘纤维—浦肯野细胞突触前末梢共表达功能性突触前 NMDAR（GluN1 阳性、Mg²⁺敏感、MK?801 敏感、离子otropic 机制）与 GlyR（strychnine 敏感、Mg²⁺不敏感），二者均能促进 CF 谷氨酸释放；其中 GlyR 通过末梢内较高 Cl? 浓度产生去极化效应，NMDAR 通过 Ca2?/Na? 内流去极化，两者可在 CF 残段引发动作电位依赖的大规模同步释放（幅值 200–600 pA 以上），TTX 可消除最大事件。免疫荧光证实 GluN1 与突触前标记 synaptophysin 共定位，peripherin 染色证实 CF 片段保留于分离细胞。脑片实验重现 glycine 诱导的大 EPSC 及其被 strychnine 阻断，表明该调节机制在完整小脑架构中存在。

主要结论翻译：

本研究首次提供证据表明，在幼年动物小脑攀缘纤维—浦肯野细胞突触存在功能性突触前 NMDA 受体与甘氨酸受体，二者均可调节谷氨酸能递质释放；由于该调节作用在无 TTX 时更为显著，若仅检测微小突触后电流（mEPSC/mIPSC）可能低估中枢其他部位类似突触前受体功能。突触前 NMDAR 可能作为自身受体被逆行释放的谷氨酸激活，GlyR 的可能甘氨酸来源为 Bergmann 胶质细胞 GlyT1 逆向转运；二者或在攀缘纤维—浦肯野细胞突触发育与修剪中发挥重要作用。