线粒体移植恢复受损小鼠骨骼肌的神经肌肉功能

《Journal of Physiology》：Restoration of neuromuscular function by mitochondrial transplantation in injured mouse skeletal muscle

　　

康复活动可改善损伤修复，但存在额外损伤的风险，并会降低再生肌肉的功能恢复。本研究检验了以下假设：中度电诱发收缩会减缓心脏毒素（cardiotoxin）诱导损伤后神经肌肉功能的恢复；然而外源性线粒体移植（MT）会增强损伤后收缩功能的恢复。将心脏毒素注射到C57BL/6小鼠（10-12周龄）的胫骨前肌以诱导肌肉坏死。在心脏毒素损伤后，通过尾静脉注射外源性线粒体或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。损伤后的肌肉要么休息，要么在恢复期间接受40 Hz亚最大电诱发收缩。与动物体内未损伤对照肌肉相比，在损伤后休息10天并接受MT而非PBS治疗的肌肉中，休息和诱发收缩恢复后的峰值强直扭矩以及抽搐扭矩的恢复更佳，且对照与损伤肌肉抽搐半弛豫时间之间的差异更低。心脏毒素损伤肌肉的神经肌肉接头（NMJ）效率约为对照未损伤肌肉的70%，但在恢复期间因诱发收缩而遭受额外损伤的肌肉中，MT在心脏毒素损伤后14天改善了NMJ产生扭矩的恢复效率。这些数据表明，当肌肉在损伤后休息时，MT增强了神经肌肉功能的恢复，但当肌肉在损伤后的恢复期面临电诱发收缩的挑战时，其提供的肌肉功能改善有限。

本研究的核心目的是探讨线粒体移植（MT）对损伤后骨骼肌神经肌肉功能恢复的作用，并评估康复性肌肉收缩对该过程的影响。肌肉损伤，无论是急性创伤还是退行性疾病，都可能导致功能障碍，影响运动员和老年人群。肌肉再生依赖于肌肉干细胞（MuSCs）的激活、增殖和分化，这是一个涉及炎症、重塑和修复的复杂过程。线粒体功能对于MuSC的代谢状态（如静息与活化）至关重要，因此线粒体健康直接影响再生能力。然而，在损伤后的康复期，进行恢复性锻炼以激活MuSC并促进再生，存在加重损伤、延缓功能恢复的风险。目前，关于如何平衡康复活动与再生肌肉脆弱性之间的矛盾，以及是否有干预措施能增强肌肉对额外负荷的适应性，尚不清楚。MT作为一种新兴疗法，通过递送健康的供体线粒体，已被证明能改善受损组织的修复。因此，本研究旨在检验两个核心假设：一是损伤后恢复期的电诱发收缩会因额外损伤而减缓神经肌肉功能恢复；二是MT能够增强心脏毒素损伤后收缩功能的恢复。研究成果发表在《Journal of Physiology》期刊上，为理解线粒体在肌肉再生中的作用以及开发新的康复策略提供了重要见解。

为了开展此项研究，研究人员采用了多种关键技术方法。实验动物模型为雄性C57BL/6小鼠（10-12周龄，购自Jackson Laboratories），通过局部注射心脏毒素至胫骨前肌诱导可控的肌肉坏死损伤。供体线粒体从同系健康小鼠的肝脏中分离纯化，并通过尾静脉系统性移植给受损小鼠。在损伤后的恢复期，部分小鼠隔日接受电刺激（40 Hz）诱发的等长收缩，以模拟康复性训练并引入轻度力学损伤。神经肌肉功能通过在体生理学测量评估，包括测定单次抽搐和最大强直收缩（100 Hz）的峰值扭矩、收缩时间、半弛豫时间，并通过比较短脉宽（100 μs）间接神经肌肉接头激活与长脉宽（2.0 ms）直接肌膜激活所产生的最大扭矩，来量化神经肌肉接头的效率。分子生物学分析包括实时定量PCR（qPCR）检测与肌生成、线粒体生物发生及血管重塑相关的基因转录水平，以及蛋白质免疫印迹（Western blot）分析线粒体呼吸链复合物蛋白的丰度。该研究方案符合ARRIVE 2.0指南，并获得了机构动物护理和使用委员会的批准。

研究人员开展了以下几部分核心研究工作：首先，验证了MT对未损伤对照肌肉功能无显著影响，排除了其对健康肌肉的直接功能性干扰。其次，研究了在损伤后休息恢复期间，MT的作用。结果显示，在伤后休息的恢复期，与PBS治疗组相比，MT显著改善了损伤肌肉的最大强直扭矩和抽搐扭矩的恢复，并恢复了抽搐收缩时间至接近对照水平。更重要的是，MT在伤后14天将神经肌肉接头的效率恢复至与未损伤对照相当的水平，而PBS组则持续低下。这表明MT通过促进肌肉收缩元件和神经肌肉接头膜的再生，从而增强了功能恢复。第三，研究了在损伤后恢复期间施加电诱发收缩（模拟康复锻炼）的影响。结果发现，即使是未损伤肌肉，在经历10天的诱发收缩后，其最大扭矩和抽搐功能也会下降，证实了康复活动本身可能导致额外损伤。在受损肌肉中，诱发收缩同样延缓了功能恢复。值得注意的是，在此挑战条件下，MT仅在恢复后期（14天）显示出部分益处，表现为改善了神经肌肉接头效率，但未能显著提升最大扭矩输出。第四，研究人员探索了MT可能的作用机制。尽管MT在休息恢复组中提高了线粒体生物发生调节因子PGC-1α和线粒体编码基因ND4的转录水平，并增加了复合物II的蛋白丰度，但它并未显著改变肌生成信号（如MyoD, MyoG）或合成代谢信号。此外，MT处理降低了与代谢信号转导和压力应激相关的PRKD1转录水平，提示MT可能通过改善代谢环境、减轻应激反应来支持修复。

最后，论文的讨论与结论部分总结指出，系统递送健康的呼吸功能线粒体，在损伤后的前10天（MuSC增殖期）并未带来显著的功能获益，但在随后的10至14天（合成代谢与重塑期）效益最为明显。这可能是因为此时神经肌肉接头膜的修复正在进行，MT通过提高神经肌肉接头效率，允许更大的扭矩输出，并与肌纤维的合成代谢生长协同作用，从而在损伤第二周产生更大的功能改善。研究人员强调，MT的益处主要体现在它促进了肌肉收缩结构和神经肌肉接头的再生修复，而非直接提供单次收缩所需的代谢优势。研究的局限性包括使用了等长收缩模型、单次全身给药剂量、以及实验动物为年轻小鼠等，这些因素可能限制了结果的外推性。结论认为，MT是增强受损神经肌肉功能恢复的一种有前景的疗法，尤其是在肌肉相对休息的恢复期，它能有效改善神经肌肉接头功能和整体收缩能力的恢复，为临床治疗肌肉损伤提供了新的思路。