《Molecular Oncology》：ESR1 methylation and ESR1 mutations in circulating tumor cells (CTCs) and paired plasma-cfDNA of advanced breast cancer patients: A feasibility proof-of-concept study
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内分泌耐药是一种复杂现象，涉及ESR1基因的改变。本研究旨在同时分析雌激素受体阳性（ER+）晚期乳腺癌（BC）患者循环肿瘤细胞（CTCs）和配对血浆-循环肿瘤DNA（ctDNA）中的ESR1启动子甲基化和ESR1热点突变。研究人员回顾性分析了42例在西北大学明
内分泌耐药是一种复杂现象，涉及ESR1基因的改变。本研究旨在同时分析雌激素受体阳性（ER+）晚期乳腺癌（BC）患者循环肿瘤细胞（CTCs）和配对血浆-循环肿瘤DNA（ctDNA）中的ESR1启动子甲基化和ESR1热点突变。研究人员回顾性分析了42例在西北大学明确CTCs和ctDNA特征的ER+晚期BC患者样本。CTCs使用CellSearch?系统进行计数，而ctDNA则使用Guardant360 NGS平台进行分析。从CellSearch富集的CTC组分中提取的基因组DNA（gDNA）经过扩增，并使用ESR1-NAPA检测进行分析。在34个样本中进行了ESR1甲基化分析。在59.5%的CTC来源样本中检测到ESR1突变，这一比例显著高于配对的血浆ctDNA（29.6%）。在26.5%的患者中观察到ESR1甲基化。在六例病例中同时发现了ESR1突变和甲基化，提示存在遗传和表观遗传的联合耐药机制。总体而言，与血浆ctDNA相比，CTC来源的gDNA在检测ESR1突变方面显示出更高的灵敏度，支持了CTC分析在表征晚期BC内分泌耐药方面的潜在价值。
乳腺癌（BC）是全球女性癌症相关死亡的主要原因。在20%-50%的早期BC患者中会发生转移性疾病。约70%的转移性乳腺癌（MBC）病例为雌激素受体（ER）阳性/HER2阴性（ER+/HER2-）。当前指南推荐内分泌治疗联合CDK4/6抑制剂作为ER+/HER2- MBC的一线治疗，这显著改善了患者预后。然而，大多数ER+ MBC患者最终会产生内分泌耐药并在一线治疗期间出现疾病进展。在疾病进展后，二线治疗策略依赖于可靶向改变的存在，包括针对ESR1突变的雌激素受体降解剂（SERDs）。液体活检是一种微创方法，主要依赖于分析循环肿瘤细胞（CTCs）和循环肿瘤DNA（ctDNA）。CellSearch?系统是唯一获得FDA批准用于检测和计数MBC患者CTCs的平台。在转移性疾病背景下，可以在血浆循环游离DNA（cfDNA）中识别出体细胞遗传改变（例如突变）。然而，除了突变，表观遗传改变现已被确立为癌症的主要标志。据研究人员所知，这是首次研究ER+晚期BC患者CTCs（从CellSearch?? cartridge中提取）和配对血浆-ctDNA（通过Guardant360 NGS平台评估）中特定的热点ESR1突变（Y537S, Y537C, Y537N, 和 D538G），同时分析CTCs中分离的gDNA的ESR1甲基化状态。研究人员开展了一项回顾性概念验证研究，旨在评估从标准化临床CTC检测工作流程中回收的CTCs作为ER+晚期BC患者遗传和表观遗传生物标志物来源的可行性。研究结果揭示了CTCs和ctDNA在检测ESR1改变方面的差异性和互补性，对优化耐药监测和治疗策略具有重要意义。该研究发表在《Molecular Oncology》。
在主要技术方法上，研究人员采用了一个由42名ER+晚期BC患者组成的回顾性队列，样本来源于西北大学Robert H. Lurie综合癌症中心。CTC的检测和计数使用CellSearch??系统完成。从CellSearch?? cartridge中回收的CTCs经过质量控制后，其基因组DNA（gDNA）被提取用于下游分析。对于ESR1突变分析，gDNA首先经过全基因组扩增（WGA），然后使用研究人员前期开发并验证的ESR1-NAPA检测法进行热点突变检测。对于ESR1甲基化分析，则使用未经WGA的gDNA，经过亚硫酸氢盐（SB）处理后，通过实时甲基化特异性PCR（MSP）进行检测。配对的血浆cfDNA样本则通过Guardant360 NGS平台进行ESR1突变分析。
研究结果部分，首先在临床样本与患者特征中，42名ER+晚期BC患者均具有激素受体阳性（HR+）肿瘤且既往接受过内分泌治疗。接着，在CellSearch?? cartridges中分离的gDNA中检测ESR1突变方面，经过质量控制的所有gDNA样本均适合进行后续突变分析。在42个CTC来源的gDNA样本中，有25个（59.5%）被鉴定出ESR1突变。其中Y537C和D538G是最常见的突变，各在42个样本中的15个（35.7%）中被检测到。Y537N变异在2个（4.8%）CTC来源的gDNA样本中被检测到，而Y537S突变在任何分析的CTC来源的gDNA样本中均未被识别。值得注意的是，7名患者（16.7%）携带多重ESR1突变。此外，在15名被CellSearch??分析判定为CTC阴性的患者中，有11人的CTC来源gDNA中检测到了ESR1突变。接下来，在直接比较CTCs中分离的gDNA与配对血浆-cfDNA中的ESR1突变方面，对于27名有匹配血浆cfDNA样本的患者，使用Guardant360检测进行分析。ESR1突变在8个（29.6%）血浆-cfDNA样本中被检测到。对27例配对样本的直接比较显示，CTC来源的gDNA中ESR1突变的检出率（17/27，63.0%）高于配对的血浆-cfDNA样本（8/27，29.6%）。CTC来源的gDNA与配对的血浆-cfDNA在至少存在一种ESR1突变方面的一致性很低，仅为44.4%（12/27）。有12例患者的ESR1突变仅在CTC来源的gDNA中被检测到，而在相应的血浆-cfDNA中未检测到。相反，有3例患者的ESR1突变仅在血浆-cfDNA中被检测到。最后，在分析CellSearch?? cartridges中分离的gDNA的ESR1甲基化方面，基于质量控制评估，34个gDNA样本适合进行下游ESR1甲基化分析。在9个（26.5%）HR+患者样本中检测到ESR1启动子甲基化。值得注意的是，在六名患者中同时确定了ESR1甲基化和ESR1点突变。
讨论部分，研究人员指出，这是首次使用高度敏感且经过分析验证的方法，探索ER+晚期BC患者CTCs和配对血浆-ctDNA中特定热点ESR1突变及CTCs gDNA中ESR1甲基化状态的研究。在HR+ BC获得性内分泌耐药的机制中，ESR1基因激活突变的出现至关重要，这些突变主要位于其配体结合域，并在芳香化酶抑制剂（AI）治疗的选择压力下产生。检测ESR1突变对晚期BC患者的管理具有重要临床意义，相关临床试验如PADA-1、EMERALD和SERENA-6已证实其价值。本研究发现，在特定检测条件下，该队列中CTC来源的gDNA比配对的血浆-cfDNA更频繁地检测到ESR1突变。这一结果与研究人员使用不同患者群体、不同CTC富集方案和完全不同的基于ddPCR的ESR1检测方法的最新报告一致。然而，该结果与Beije等人的研究相矛盾，后者报道在CellSearch??富集的CTC组分中使用数字PCR检测ESR1突变的灵敏度低于cfDNA。一个特别有趣的观察结果是在常规CellSearch??计数判定为CTC阴性的患者样本中检测到了ESR1突变。这可能反映了经历上皮间质转化（EMT）的CTCs的表型可塑性，导致上皮标志物表达降低。在27名有配对样本的患者中，联合分析CTC来源的gDNA和血浆-cfDNA显示ESR1突变的总阳性率非常高（20/27，70.1%）。观察到的CTC来源gDNA与配对血浆-cfDNA之间ESR1突变检测的低一致性（44.4%），支持了CTCs和cfDNA分别探索肿瘤异质性和动态的不同但互补方面的观点。关于不一致性的可能原因包括肿瘤异质性导致不同亚克隆群体贡献于CTCs或cfDNA、两者在生物学来源和动力学上的差异，以及分析物水平极低。与此同时，同一CTC来源样本中ESR1启动子甲基化的分析揭示了26.5%的超甲基化。在六名患者中，ESR1启动子甲基化与激活突变共存，表明遗传和表观遗传改变可能共存并协同导致内分泌耐药。尽管结果新颖，但本研究存在一些局限性，包括回顾性分析、队列较小且异质性强、探索性研究性质，以及CellSearch cartridge中可能存在的肿瘤源性碎片或凋亡细胞等方法学限制。CellSearch CTC计数与ESR1突变检测之间的差异进一步支持了CTC显著异质性的概念。
结论部分指出，尽管具有探索性，但本研究在CTCs的遗传和表征方面展示了引人入胜的结果。在本队列及所采用的特定实验和分析条件下，CTC来源的gDNA比配对的血浆-cfDNA更频繁地检测到ESR1突变，这与研究人员近期使用ddPCR的报告一致，尽管基于不同的CTC富集系统、不同的ESR1突变检测方法和独立的患者队列。这些发现表明，CTC分析可能是一种评估内分泌耐药和肿瘤异质性的非常敏感的方法，并对ctDNA分析形成补充。需要进一步的研究来确定这些特征的预测影响，届时将使用相同的生物标志物和协调的检测平台直接比较CTCs与配对的血浆-ctDNA。
