基于理性设计的V形DNA靶向光敏剂实现内源性DNA损伤驱动的cGAS-STING激活与全身抗肿瘤免疫

《Materials Today Bio》：Rational Design of a V-Shaped DNA-Targeted Photosensitizer Enables Endogenous DNA Damage-Driven cGAS-STING Activation and Systemic Antitumor Immunity

　　

研究人员报道了一种V形光敏剂2C6，其作为原位DNA片段化试剂直接靶向双链DNA（dsDNA）。得益于其A-π-D-π-A分子框架，2C6在低功率白光照射下表现出高效的活性氧（ROS）生成能力。2C6的光活化同时诱导线粒体和细胞核DNA损伤，导致氧化的dsDNA片段在细胞质中积累，这与cGAS-STING信号通路的激活密切相关。与此同时，2C6光动力治疗（PDT）诱导焦亡和免疫原性细胞死亡（ICD），这通过升高的焦亡相关标志物（包括NLRP3、cleaved caspase-1和GSDMD）水平以及ICD特征（如CRT暴露、ATP分泌和HMGB1释放）得到证实。在小鼠4T1三阴性乳腺癌（TNBC）术后残留模型中，单次术中2C6-PDT治疗预防了局部肿瘤复发，在观察期内建立了免疫记忆，并且在不使用免疫佐剂的情况下抑制了远处肿瘤生长和肺转移。总之，2C6通过一个明确的级联反应（包括DNA损伤、dsDNA积累、cGAS-STING参与、炎症信号传导和免疫细胞浸润），将光诱导的DNA损伤与细胞质dsDNA感知、I型干扰素信号传导和适应性免疫激活相耦联。这些发现共同证明，合理设计的DNA靶向光敏剂可以将局部光动力肿瘤消融转化为系统性光免疫治疗反应，为将免疫“冷”肿瘤转化为免疫响应状态提供了一种策略。

在《Materials Today Bio》发表的这项研究中，研究人员旨在解决如何安全、高效地在实体瘤中激活抗肿瘤免疫核心通路——环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）通路的科学难题。cGAS-STING通路是感知胞质双链DNA（dsDNA）并驱动I型干扰素产生的关键先天免疫监视机制，能协调先天与适应性免疫以塑造抗肿瘤反应。然而，在实体瘤中高效且可控地激活该通路面临巨大挑战，因为通路受到严格调控且高度依赖环境，其免疫学结果取决于dsDNA生成、胞质积累和酶促降解之间的平衡。不足的dsDNA积累无法维持信号，而过度或不可控的激活可能导致免疫耗竭、免疫抑制或系统毒性。因此，亟需一种能够在肿瘤内精确诱导内源性dsDNA积累，同时保持时空控制的策略。现有方法主要依赖外源性STING激动剂，但其存在肿瘤选择性差、快速清除和剂量限制性毒性等问题。光动力治疗（PDT）因其能在时空控制下产生损伤线粒体DNA（mtDNA）的ROS而备受关注，但其生成的mtDNA泄露激活cGAS-STING的效率有限，且大多数光敏剂缺乏对dsDNA的固有亲和力和靶向性。因此，这项研究的核心在于设计一种能直接靶向DNA的光敏剂，使PDT产生的氧化损伤高效转化为胞质dsDNA片段，从而内源性激活cGAS-STING通路，将局部治疗转化为全身性免疫反应。

研究人员开展的研究工作主要包括以下几个关键技术方法：首先，基于三苯胺（TPA）支架，通过结构-功能设计原则理性构建了一系列V形聚集诱导发光（AIE）光敏剂，特别是优化了双取代（BS）衍生物2C6，其具有高亲和力的dsDNA结合能力和优化的A-π-D-π-A电子框架。其次，系统评估了这些光敏剂的光物理性质、DNA结合特性（通过荧光滴定、竞争置换实验和分子对接模拟）、ROS生成效率（使用DCFH-DA、ABDA探针及电子顺磁共振（ESR）技术）以及细胞内定位（通过共聚焦显微镜与细胞器探针共定位）。接着，在4T1细胞水平上，研究了光敏剂诱导的DNA损伤（通过γ-H2AX、8-OHdG免疫荧光和TUNEL检测）、dsDNA释放、焦亡和ICD相关标志物（NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD、CRT、ATP、HMGB1）的表达，以及cGAS-STING信号通路相关蛋白（p-STING, p-TBK1, p-IRF3）的活化。此外，利用转录组测序（RNA-seq）分析了不同处理组4T1细胞的基因表达谱变化。最后，构建了小鼠4T1术后残留肿瘤模型、远处肿瘤再挑战模型和肺转移模型，通过流式细胞术分析免疫细胞亚群（如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、效应记忆T细胞（TEM）、成熟树突状细胞（DC）），ELISA检测血清细胞因子（如TNF-α、Cxcl10、IL-6、IL-12p70），以及组织病理学分析来评估2C6-PDT的体内抗肿瘤复发、转移抑制及免疫记忆形成效果。所有动物实验均使用海南分威生物科技有限公司提供的BALB/c小鼠，并遵循海南大学实验动物伦理委员会批准的程序（HNUAUCC-2021-00021）。

研究结果如下：

3.1. 分子设计、合成与光物理性质。研究人员基于TPA支架，理性构建了两种V形光敏剂2C4和2C6。螺旋桨状的TPA作为强电子供体（D），吡啶阳离子同时充当电子受体（A）和线粒体靶向基团。D和A基团通过C=C π桥连接，形成扩展的A-π-D-π-A共轭框架以增强分子内电荷转移（ICT）。为调节分子两亲性并降低在水介质中的聚集，引入了不同链长的烷基化吡啶基团。所得的两亲性平衡使其能在生理环境中实现单分子分散，并促进与dsDNA的高效分子相互作用。此外，特意引入V形几何结构以促进其插入dsDNA沟槽，从而增强多模式DNA结合（插层、沟槽结合和静电相互作用）。所有探针均通过克诺文格尔缩合反应制备，并通过1H NMR、13C NMR和高分辨质谱（HRMS）进行了表征。

3.2. 探针-DNA相互作用验证与ROS生成性能评估。通过荧光滴定、检测限（LOD）分析、竞争置换实验和分子对接模拟系统研究了AIEgen与dsDNA的亲和力和结合模式。随着牛胸腺DNA（ctDNA）的增加，所有探针均产生显著的发射增强，其中BS衍生物2C4和2C6表现出最强的开启响应（I/I0分别为17和30），其LOD分别达到0.004和0.001 μg mL^-1，远低于单取代（MS）类似物1C4和1C6。竞争置换实验显示，2C4和2C6对商业探针PO-PRO-1和DAPI的荧光猝灭因子超过探针本身，揭示了其涉及协同沟槽结合和静电嵌入的多模式dsDNA结合。分子对接模拟进一步证实，2C4和2C6与dsDNA的计算结合能（BE）分别为-9.50和-9.72 kcal mol^-1，显著低于MS类似物和商业探针。ROS生成能力评估表明，2C6在低功率照射下表现出最高的ROS产量。电子自旋共振（ESR）分析证实其能同时生成•O₂^-、•OH和¹O₂，表明其同时涉及电子转移（I型）和能量转移（II型）光化学途径。

3.3. 细胞内ROS监测、共定位与线粒体损伤。在4T1细胞中评估了AIEgen的细胞内ROS生成能力。在光照下，所有四种光敏剂均产生明显的绿色荧光，其中BS-PS（2C4和2C6）的荧光增强因子（分别为6.2和16.4）远高于MS-PS（1C4和1C6）（分别为2.8和5.9）。Western blot分析显示，所有光敏剂处理组均呈现光照依赖性的NLRP3（一种焦亡相关标志物）上调，其中2C4和2C6诱导的增加最显著。免疫荧光染色进一步证实了2C6+L处理组4T1细胞中焦亡标志物caspase-1和GSDMD表达的增加。亚细胞定位研究表明，所有光敏剂均能强力靶向线粒体。值得注意的是，照射9分钟后，MS-PS与细胞核的皮尔逊相关系数极低（0.03和0.02），而BS-PS（2C4和2C6）与DAPI的系数达到0.48和0.46，表明其在氧化应激条件下发生了从线粒体到细胞核的转位，从而能够诱导核DNA损伤。

3.4. ICD机制和cGAS-STING通路的细胞水平激活。研究评估了ICD相关损伤相关分子模式（DAMPs）。免疫荧光分析显示，2C6+L组的钙网蛋白（CRT）表面暴露增加最高（7.3倍）。细胞外ATP水平在光照后显著升高，2C6+L组增加最显著。HMGB1的免疫荧光染色显示其发生明显的核质转位，同样在2C6+L组最为显著。这些结果证实了2C6有效诱导了ICD。分子对接显示V形BS-PS对mtDNA也具有强亲和力。Western blot证实，L组中γ-H2AX（DNA双链断裂标志物）显著上调，BS-PS诱导的增加最大。免疫荧光染色（γ-H2AX、8-OHdG、TUNEL）进一步证实了广泛的双链断裂和片段化，在2C6+L组最突出。对细胞培养上清液的定量分析表明，L组中dsDNA浓度显著升高，其中2C6+L组dsDNA释放水平最高，是对照组的25.6倍。Western blot分析显示，2C6+L组中cGAS-STING通路相关蛋白（p-STING, p-TBK1, p-IRF3）的磷酸化水平增加。酶联免疫吸附测定（ELISA）显示，2C6+L组的Cxcl10水平显著升高，是对照组和D组的3.8和3.9倍，与cGAS-STING通路的激活一致。

3.5. 转录组分析。对不同处理组（对照组、1C6+L和2C6+L）的4T1细胞进行了RNA-seq分析。2C6+L与对照组比较产生的差异表达基因（DEGs）最多，共有12822个，其中844个显著上调，1269个下调。维恩图显示2C6+L与对照组比较具有305个独特上调基因和367个独特下调基因。关注与细胞死亡、DNA修复、免疫信号和应激反应相关的关键功能基因发现，相对于对照组和1C6+L组，2C6+L诱导的转录特征显示抗凋亡基因（Bcl2, Bdnf）、DNA修复基因（H2ax, Msh5, Plk1）、上皮-间充质转化（EMT）基因（Vim, Tns1等）和血管生成基因（Ramp2）下调。相反，促凋亡基因（Bax, Atf3）、促焦亡基因（Hspa8）以及一系列cGAS-STING通路效应基因和免疫调节基因（TBK1, Cxcl10, Cxcl1等）被强烈上调。基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析进一步证实，2C6+L组中上调基因在氧化应激反应、炎症通路、凋亡和先天/适应性免疫信号方面显著富集。

3.6. 预防术后肿瘤复发及其潜在免疫机制。建立了不完全切除（约去除90%）的4T1原位术后残留模型。小鼠被随机分为三组（每组n=6）：对照组（PBS+光照）、2C6+D组（2C6无光照）和2C6+L组（2C6+光照）。在对照组和2C6+D组，肿瘤在第7天后明显再生，并在第25天迅速增大至1038 mm³和555 mm³。相反，在观察期内，2C6+L组未检测到明显的可触及复发。宏观和重量分析显示，对照组和2C6+D组形成大肿瘤（>1 cm，平均重量分别为0.93 g和0.73 g），而2C6+L组在终点未观察到明显的残留肿瘤组织。Kaplan-Meier分析显示，2C6+L组在第55天的无复发生存率为83.33%，而对照组和2C6+D组小鼠分别在第46天和第55天全部死亡。免疫组化分析显示，2C6-PDT显著改变了多种机制标志物，包括ICD/焦亡标志物（CRT, IL-18）、DNA损伤指标（γ-H2AX, 8-OHdG, TUNEL）、cGAS-STING通路激活标志物（cGAS, STING, p-IRF3）、免疫重塑标志物（细胞因子IFN-β, TNF-α；巨噬细胞极化标志物CD206, CD86；树突状细胞成熟标志物CD80；T细胞活化和记忆标志物CD4, CD8, IFN-γ, GzmB, CD44）。同时，EMT关键标志物波形蛋白（Vim）在2C6+L组的表达降低了78.1%。这表明2C6介导的PDT通过多种相互关联的机制发挥强大的抗肿瘤免疫效应。

3.7. 抑制远处肿瘤生长和肺转移及其相关机制。为了确定2C6-PDT是否能诱导全身性免疫激活和免疫记忆，通过流式细胞术分析了关键免疫细胞亚群。2C6+L组显示出明确的系统性免疫激活增强，包括淋巴结中成熟树突状细胞（CD80+CD86+）群体的增加，以及脾脏中CD4+、CD8+和效应记忆T细胞（TEM）频率的升高。血清细胞因子分析进一步支持了这种系统性免疫激活。2C6+L组相对于对照组和2C6+D组，促炎和免疫刺激性细胞因子（包括TNF-α、Cxcl10、IL-6和IL-12p70）显著增加。为了评估这种免疫激活是否对远处肿瘤挑战提供长期保护，将观察期内无复发的小鼠用4T1细胞在远处部位进行再挑战。空白对照组肿瘤迅速发展，而在再挑战期间，无复发的小鼠未观察到明显的肿瘤生长。在终点，空白组存在超过1 cm的肿瘤肿块，而无复发的小鼠未发现可见肿瘤。这证明了2C6-PDT诱导的免疫记忆提供了强大的保护，以抵御远处肿瘤的再挑战。为了评估对转移性播散的保护作用，在观察期内通过尾静脉将4T1细胞注射到无复发小鼠和空白对照组中。8天后，通过H&E染色检查肺组织。空白组显示出广泛的转移结节，而无复发的小鼠在终点未观察到明显的转移结节，表明强烈抑制了转移性定植。体重监测和主要器官组织学分析证实了良好的生物安全性。

总结讨论部分与研究结论翻译如下：

本工作确立了一种DNA靶向光敏剂2C6的理性设计策略，将强效光动力活性和自主免疫激活整合到单一分子框架中。通过工程化一种具有高dsDNA亲和力和优化A-π-D-π-A电子框架的V形分子结构，2C6在低功率光照下可作为内源性DNA损伤的精确诱导剂。光照下，2C6诱导局部线粒体和细胞核DNA损伤，产生可能有助于激活cGAS-STING的细胞质片段化dsDNA。同时，强烈的氧化应激与焦亡和ICD相关，这通过NLRP3和IL-18释放、CRT暴露、ATP释放和HMGB1转位得到证实。与cGAS-STING和ICD相关的协同表型建立了一个自我放大的免疫原性级联反应，从而促进肿瘤微环境重塑，表现为树突状细胞成熟增强、巨噬细胞向抗肿瘤M1表型极化，以及CD4+和CD8+ T细胞的大量浸润和功能激活。这种局部PDT诱导了系统性抗肿瘤免疫反应，其特征是EMT抑制、转移性播散限制和效应记忆T细胞反应增强。本研究中观察到的免疫学效应源于2C6分子设计所实现的DNA损伤、先天感知和ICD的独特融合。与主要破坏细胞膜或单个细胞器的常规光敏剂不同，2C6直接结合dsDNA并在光活化后诱导线粒体和细胞核DNA的同步损伤。这种双细胞器损伤放大了dsDNA片段的产生和胞质持续存在，从而可能驱动持续的cGAS-STING信号传导。与此同时，强烈的氧化应激激活NLRP3炎性小体和焦亡细胞死亡，增强了促进抗原呈递的DAMPs释放。这些过程的耦合为局部光动力损伤如何转化为全身免疫激活提供了机制解释。通过同步内源性DNA损伤与ICD，2C6-PDT桥接了先天免疫感知和适应性免疫启动，从而克服了常规PDT通常诱导不足或短暂免疫反应的关键限制。与依赖外源性激动剂或金属增敏剂的策略不同，本文描述的方法利用原位产生的内源性dsDNA作为激活信号，从而通过光照照射保持了空间限制和时间控制。这种内源性激活模式最大程度地减少了对外部免疫佐剂的依赖，并降低了脱靶免疫刺激的风险。重要的是，研究结果表明PDT的免疫学结果不仅取决于氧化应激的大小，还取决于其亚细胞背景和分子靶点。合理的DNA靶向使得ROS介导的损伤优先转化为免疫刺激信号，而非非特异性细胞毒性。这一区别突显了光免疫治疗的设计原则，即精确的分子参与而非仅仅增加光毒性决定了免疫激活效率。一些局限性也应考虑。首先，依赖光照照射将当前方法主要限制于浅表或术中可及的肿瘤。其次，虽然增强的DNA损伤有利于免疫激活，但对正常增殖组织的潜在脱靶效应需要仔细评估剂量和照射参数。第三，本研究集中于同基因小鼠肿瘤模型；需要在额外肿瘤类型和更具临床相关性的模型中进行验证以评估转化潜力。未来的研究可以探索靶向DNA光动力疗法在其他肿瘤模型中的验证。