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摘要：炎症可激活血细胞，参与衰老及恶性转化。造血干细胞（Haematopoietic stem cells, HSCs）终身经历感染以维持终生造血，但人HSCs如何响应及适应炎症应激在很大程度上未知。本研究为实证理解该适应机制，研究人员建立了异种移植炎症—恢复
摘要：炎症可激活血细胞，参与衰老及恶性转化。造血干细胞（Haematopoietic stem cells, HSCs）终身经历感染以维持终生造血，但人HSCs如何响应及适应炎症应激在很大程度上未知。本研究为实证理解该适应机制，研究人员建立了异种移植炎症—恢复模型，并对异种移植的人HSCs进行单细胞多组学（single-cell multiomics）分析。研究人员鉴定出两个转录及表观遗传（epigenetically） distinct的HSC亚群，其中之一被命名为HSC炎症记忆（HSC inflammatory memory, HSC-iM）亚群，可保留既往炎症处理的分子记忆。HSC-iM亚群表现为静息（quiescence）及受抑的造血输出（haematopoietic output）。分子水平上，HSC-iM程序在来源于成人及儿童样本的HSCs中均富集，这些样本涵盖COVID-19康复期、镰状细胞病（sickle cell disease, SCD）、衰老及克隆性造血（clonal haematopoiesis, CH），证实了异种移植模型的效度及HSC-iM的生理相关性。CH相关突变在HSC-iM中通过促进HSC激活与分化减弱了炎症应激的影响。此外，在异种移植及生理条件下均证实HSC-iM的促炎转录程序可传递至分化的免疫后代细胞。最后，循环血细胞中HSC-iM程序富集与人群队列分析中全因死亡风险评分升高相关，凸显了该新鉴定HSC亚群在表征终生异质性健康结局中的临床相关性。
《Nature》发表的本研究针对人长期造血干细胞（long-term haematopoietic stem cell, LT-HSC）在终身经历感染、炎症刺激后是否及如何产生持久的分子适应性改变这一未解问题展开。已有小鼠研究表明炎症可诱导造血干细胞（HSC）激活、自我更新受损及表观遗传重塑，并影响克隆性造血（clonal haematopoiesis, CH）的克隆选择，但人HSC区室高度异质，其对炎症的异质性响应及是否保留"炎症记忆"缺乏实证。本研究通过建立人脐带血（cord blood, CB）异种移植炎症—恢复模型，结合单细胞转录组与染色质可及性测序（single-cell multiome RNA + ATAC-seq, scMultiome）、人原代HSC临床样本验证及克隆性造血（CH）队列分析，首次在人系统中鉴定出具有炎症记忆特征的HSC亚群——HSC-iM（HSC inflammatory memory），阐明其转录—表观遗传特征、在炎症/衰老/疾病中的富集、与CH突变的交互作用及其程序向下游成熟免疫细胞传递的现象与临床关联。
主要关键技术方法
研究人员建立NSG小鼠异种移植模型，对移植后小鼠予单次或重复肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor, TNF）或脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）处理模拟急性或反复炎症，设恢复期取骨髓人造血干/祖细胞（human HSPC）；采用10x Genomics scMultiome（RNA + ATAC）及scRNA-seq对人HSPCs及下游祖细胞/髓系细胞测序；应用非负矩阵分解（consensus non-negative matrix factorization, cNMF）、加权最近邻（weighted nearest-neighbour, WNN）整合、SCENIC+推断转录因子调控网络、基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）；利用原代人样本包括COVID-19康复患者外周血HSC snRNA+ATAC、镰状细胞病（sickle cell disease, SCD）患儿骨髓HSC、多中心年龄梯度健康供体HSC scRNA-seq、携带DNMT3A或TET2突变的CH供体骨髓TARGET-seq+数据及安大略健康研究（Ontario Health Study, OHS）外周血scRNA-seq队列进行跨场景验证；通过极限稀释移植（limiting dilution assay）评估长期重建功能，利用遗传多态性及线粒体DNA谱系追踪推断克隆起源与子代关系。
研究结果
Inflammatory response priming in LT-HSC
研究人员对静息状态下人CB LT-HSC（Lin?CD34+CD38?CD45RA?CD90+CD49f+）进行scRNA-seq，cNMF分解出静息（quiescence）与炎症信号（inflammatory signalling）两大转录程序，后者与AP-1及NF-κB转录因子结合基序染色质开放相关，在独立snRNA+ATAC数据中验证，表明人HSC-MPP内存在基础炎症预编程异质性。
Modelling human HSC inflammation in vivo
单次TNF或LPS处理后16 h人移植物hCD45+及hCD34+祖细胞减少，但单次打击后长期恢复且干细胞频率不变；反复（两次）TNF/LPS打击后恢复期移植物仍显著缩小、CD34+比例降低，但二次极限稀释移植示HSC重建频率未丧失，表明反复炎症致人HSC产生持久功能性改变而非自我更新潜能丧失。
Identification of two human HSC subsets
从炎症—恢复异种移植HSPCs scMultiome中鉴定出两群HSCs：HSC-I与HSC-II（后命名HSC-iM）。HSC-iM（原HSC-II）富集静息特征、TNF-via-NF-κB及TGFβ信号通路、NFKB1/REL/JUNB/FOS/SMAD3调控网络，具3,663个差异可及染色质区域及2,178个差异表达基因，与HSC-I转录—表观遗传明显分离，且在炎症处理后分离度增大。
HSC-II retain memory of inflammation（HSC-iM保留炎症记忆）
恢复后HSC-iM较HSC-I显示TNF/LPS特异的转录因子活性持续上调（如NFKB1、JUNB、HMGA1、SPI1），证明炎症消退后分子改变主要在HSC-iM持久存在。HSC-iM染色质及转录程序与人的CD8+记忆T细胞（TM）共享AP-1家族基序（5′-TGAG/CTCA-3′），区别于BCG诱导的"训练免疫（trained immunity）"程序，表明HSC-iM是具炎症记忆特征的独特HSC状态。
HSC-iM in pathophysiological contexts
HSC-iM程序在ICU-COVID康复患者（重症COVID-19感染后2–4个月）外周血HSCs染色质可及性及转录水平显著高于ICU对照及健康供体；在中老年人（40–90岁）HSCs中较青年（18–40岁）显著富集并与已发表老化HSC标志重叠；在儿童SCD患者HSCs中也显著富集，证实HSC-iM反映累积炎症负荷——见于严重感染、炎性衰老及慢性炎症性疾病。
HSC-iM in CH（克隆性造血中的HSC-iM）
在原代CH（DNMT3A/TET2突变）骨髓HSC scRNA-seq中，xenograft衍生的HSC-I/HSC-iM特征完美区分骨髓HSC1/HSC2（HSC2≈HSC-iM）。CH供体无论野生型或突变HSC均较非CH对照富集HSC-iM程序，且与CH克隆大小正相关。CH突变引起的基因表达及TF活性改变主要发生在HSC-iM而非HSC-I，DNMT3A/TET2突变削弱HSC-iM固有静息/分化阻滞、促其向髓系分化，提示CH突变通过解除HSC-iM的分化抑制获得选择优势。
CH impacts HSC-iM differentiation（CH影响HSC-iM分化）
HSC-iM主导的CH-WT层次中早期祖细胞频率低于HSC-I主导者，符合HSC-iM低输出；但CH-mutant细胞在HSC-iM背景下分化增强。异种移植骨髓CH样本示TNF处理增加DNMT3A突变（混合HSC-I/HSC-iM）移植物大小，遗传克隆追踪示HSC-iM与HSC-I均可产子代，HSC-iM来源子代在早期祖池中占比偏低。
Mature progeny retain features of HSC-iM（成熟子代保留HSC-iM特征）
基于脐带血多态性遗传克隆推断，HSC-iM来源的早期祖细胞、单核细胞较HSC-I来源持续富集HSC-iM转录及炎症信号程序，在原代骨髓、COVID-19康复者单核细胞、线粒体DNA谱系追踪数据中重复验证，表明HSC-iM炎症程序可遗传至分化后的淋巴—髓系成熟细胞。安大略健康研究外周血scRNA-seq示年轻人中B细胞/naive T细胞/dendritic cells的HSC-iM评分与高改良Intermountain Risk Score（IRS）相关，提示HSC-iM通过子代影响全身炎症及死亡风险。
讨论（结论部分翻译）
本研究报道了一个新的HSC亚群——HSC-iM，可保留既往炎症的转录及表观遗传记忆。实验鉴定的HSC-iM分子程序反映了严重COVID-19感染、伴炎症的遗传血液病、衰老及CH等多种人生理与疾病状态下累积的炎症侵袭，支持小鼠及人组织干细胞间保守的炎症记忆程序概念。T细胞记忆与HSC-iM程序的相似性提示长期存活血细胞在反复炎症刺激恢复后有保守响应。此外，HSC-iM来源的淋巴—髓样子代继承包括炎症信号在内的HSC-iM转录特征，鉴于多数成熟血细胞寿命短，提示HSC-iM来源子代可能持续主动影响或改变免疫应答，有放大系统性炎症的潜力。因此HSC-iM构成感染与炎症史、人衰老及造血系统克隆性疾病间重要的细胞联系。研究人员提出HSC-iM是炎症适应产物——部分HSCs进入休眠可能是为保护干细胞池完整性，代价是HSC-iM积累与年龄相关造血功能障碍及更高死亡率风险关联。CH-WT与CH-mutant均过代表征HSC-iM，CH突变主要在HSC-iM中改变基因表达并缓解其静息阻滞从而促进髓系产出，HSC-iM富集程度与CH克隆大小强相关。综上，通过可遗传分子改变保留既往炎症应激记忆的HSC亚群，为研究衰老及年龄相关疾病所致健康异质性提供了新的细胞框架。
