αKG介导的肉碱合成通过组蛋白乙酰化驱动DNA修复

《Nature》：αKG-mediated carnitine synthesis drives DNA repair via histone acetylation

　　

摘要：同源重组（Homologous Recombination，HR）缺陷可增加肿瘤细胞对临床常用DNA损伤剂（如PARP抑制剂、顺铂、放疗）的敏感性，但在HR熟练（HR?proficient）肿瘤中，驱动其对DNA损伤剂产生应答或耐药的代谢机制尚不清楚。本研究发现，α?酮戊二酸（α?ketoglutarate，αKG）耗竭可通过代谢调控组蛋白乙酰化，使HR?熟练细胞对DNA损伤剂增敏。αKG是αKG依赖双加氧酶（αKG?dependent dioxygenases，αKGDDs）的必需辅底物，既往研究几乎均聚焦于αKGDDs的组蛋白/DNA去甲基化功能。研究人员利用靶向64种αKGDDs的CRISPR敲除文库筛选发现，脱氢三甲赖氨酸羟化酶ε（trimethyllysine hydroxylase epsilon，TMLHE）——从头肉碱（carnitine）合成的第一步限速酶——是HR?熟练细胞在DNA损伤剂存在下存活所必需的。出乎意料的是，αKG介导的TMLHE依赖性肉碱合成是组蛋白乙酰化所必需的，且该作用不同于其他核质乙酰?CoA生成途径（如ATP?柠檬酸裂解酶ACLY途径），二者互不冗余。αKG–肉碱轴通过提高位点特异性组蛋白乙酰化水平促进HR介导的DNA双链断裂修复。最后，研究人员在临床样本中观察到TMLHE表达与组蛋白乙酰化呈正相关，且高TMLHE或高乙酰肉碱（acetylcarnitine）与接受DNA损伤剂治疗的卵巢癌患者较差的无进展生存期（Progression?Free Survival，PFS）相关。本研究首次揭示αKG可通过影响位点特异性组蛋白乙酰化参与HR熟练性的维持，并提出αKG–TMLHE–肉碱轴是HR?proficient肿瘤耐药的新代谢机制，为该轴作为诱导HR缺陷、增敏DNA损伤剂的干预靶点提供了依据。

论文解读——《αKG介导的肉碱合成通过组蛋白乙酰化驱动DNA修复》

研究背景与立项依据

DNA双链断裂（Double?Strand Break，DSB）的精确高效修复对基因组稳定性至关重要，其中同源重组（HR）是其主要修复途径之一。HR缺陷肿瘤（如BRCA1/2突变）对PARP抑制剂及铂类化疗敏感，但HR?熟练（HR?proficient）肿瘤因具备固有修复能力而表现出原发耐药，是临床治疗难点。组蛋白翻译后修饰（Post?Translational Modification，PTM）尤其是乙酰化可调控染色质开放及修复因子招募从而影响DSB修复。α?酮戊二酸（α?ketoglutarate，αKG）是三羧酸循环中间产物及αKG依赖双加氧酶（αKG?Dependent Dioxygenase，αKGDD）的必需辅底物，既往研究集中于αKGDD介导的组蛋白/DNA去甲基化对修复的影响，而αKG是否通过其他αKGDD调控组蛋白乙酰化进而影响HR尚无报道。部分促癌基因（如CCNE1、MYC）可上调αKG水平并使肿瘤呈HR?proficient表型，但其代谢–表观–修复偶联机制不明。本文研究人员旨在阐明αKG是否通过特定αKGDD及下游代谢物调控组蛋白乙酰化和HR修复，并评估其临床转化价值。该论文发表于《Nature》。

主要关键技术方法

研究人员采用以下关键实验体系与技术：（1）CCNE1或MYC过表达的HR?proficient卵巢癌细胞系（Ovcar8、FT282）及对应空载体对照，辅以IDH1抑制剂（GSK864）耗竭αKG或谷氨酰胺饥饿模型，并用外源αKG、L?肉碱、O?乙酰?L?肉碱回补；（2）靶向64种αKGDDs的CRISPR sgRNA敲除文库进行DNA损伤剂（奥拉帕尼olaparib）压力下的负筛选，锁定TMLHE；（3）shRNA敲低TMLHE或肉碱合成抑制剂mildronate（美曲腚）处理验证表型；（4）LC?MS/MS检测代谢物（αKG、肉碱、乙酰肉碱、酰基?CoA）及同位素示踪（d9?TML、¹³C₂?乙酰肉碱、¹³C₆?葡萄糖）；（5）Western blot及质谱定量组蛋白乙酰化位点（H3K23ac、H4K8ac、H4K12ac等）；（6）免疫荧光检测γH2AX、RAD51焦点及U2OS?mCherry?LacI?FokI诱导DSB位点RAD51/BRCA1共定位；（7）非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵提取物无转录HR修复体系；（8）染色质免疫沉淀（ChIP?qPCR）检测DSB位点组蛋白修饰及修复因子富集；（9）小鼠CCNE1过表达异种移植瘤模型评估IDH1i或mildronate联合DNA损伤剂的体内疗效；（10）人高级别浆液性卵巢癌组织芯片（TMA）及新诊断患者血清乙酰肉碱水平与组蛋白乙酰化、无进展生存期（PFS）相关性分析。

研究结果

αKG drives drug resistance via TMLHE（αKG通过TMLHE驱动DNA损伤剂耐药）

CCNE1或MYC过表达上调细胞内αKG；IDH1抑制或谷氨酰胺缺失降低αKG并使HR?proficient细胞对olaparib、cisplatin及γ射线增敏，该增敏可被外源αKG而非柠檬酸逆转。CRISPR αKGDDs敲除文库筛选显示TMLHE在olaparib处理下显著负富集；shRNA敲低TMLHE或用mildronate抑制肉碱合成同样使细胞对DNA损伤剂增敏，且可被L?肉碱或O?乙酰?L?肉碱而非αKG回补，证实TMLHE及从头肉碱合成位于αKG下游并是HR?proficient细胞耐药所必需。

αKG increases carnitine synthesis（αKG促进肉碱合成）

αKG耗竭降低细胞内L?肉碱、乙酰肉碱及总肉碱，补充αKG可恢复；体内小鼠移植瘤IDH1抑制亦降低瘤内αKG、L?肉碱和乙酰肉碱。DepMap数据库细胞系αKG与肉碱/乙酰肉碱正相关。d9?TML同位素示踪显示IDH1抑制降低TMLHE催化产物羟基三甲赖氨酸（hydroxytrimethyllysine，HTML）与TML比值（HTML:TML），αKG可回补，证明αKG依赖TMLHE活性调控从头肉碱合成。

αKG drives histone acetylation（αKG驱动组蛋白乙酰化）

IDH1抑制、谷氨酰胺缺失、琥珀酸（succinate，αKGDD竞争性抑制剂）处理或TMLHE敲低均降低组蛋白H3/H4泛乙酰化（pan?H3ac、pan?H4ac）及特定位点（H3K23ac、H4K8ac、H4K12ac），不影响组蛋白甲基化；该降低可被αKG（IDH1抑制/谷氨酰胺缺失模型）或L?肉碱/O?乙酰?L?肉碱（TMLHE敲低模型）回补，但不被丙酰肉碱/丁酰肉碱或抗氧化剂NAC回补，排除能量与ROS效应。核内乙酰?CoA在TMLHE敲低下调。组蛋白乙酰转移酶（HAT）抑制剂使细胞对DNA损伤剂增敏且不能被αKG/肉碱逆转，表明αKG–肉碱轴通过组蛋白乙酰化而非下游间接效应发挥作用。

Non?redundant TMLHE?mediated acetylation（TMLHE介导的组蛋白乙酰化为非冗余途径）

敲低肉碱O?乙酰转移酶（Carnitine O?acetyltransferase，CrAT）或肉碱O?辛酰转移酶（Carnitine O?octanoyltransferase，CrOT）降低组蛋白乙酰化及葡萄糖来源核乙酰?CoA，并使细胞对DNA损伤剂增敏，证明肉碱–乙酰肉碱穿梭提供核乙酰?CoA池。¹³C₂?乙酰肉碱可掺入组蛋白特异乙酰化位点。ACLY（ATP?citrate lyase）敲低也降低乙酰化但不完全消除，TMLHE与ACLY双敲在低乙酰化及DNA损伤剂增敏上呈加性效应，表明TMLHE依赖的肉碱–乙酰肉碱轴与ACLY途径平行、互不冗余，共同提供核乙酰?CoA用于组蛋白乙酰化。

αKG–carnitine regulates specific marks（αKG–肉碱轴调控特异性组蛋白乙酰化标记）

定量组蛋白修饰质谱鉴定出H3K23ac、H4K8ac、H4K12ac三种受αKG–TMLHE–肉碱轴特异性调控的乙酰化标记，在IDH1抑制或TMLHE敲低下调且可被αKG/L?肉碱回补，¹³C₂?乙酰肉碱可直接掺入这些标记。

αKG suppresses DNA damage through carnitine（αKG通过肉碱抑制DNA损伤并促进HR修复）

IDH1抑制或TMLHE敲低增加γH2AX焦点（内源性DNA损伤及损伤剂处理后），减少RAD51焦点及DSB诱导的RAD51/BRCA1招募至损伤位点，上述可被αKG、L?肉碱或O?乙酰?L?肉碱回补。Xenopus卵提取物体系中IDH1抑制增加线性DSB、减少HR重连分子，αKG可回救。U2OS?LacI?FokI诱导DSB模型中，IDH1抑制延缓DSB清除、减少RAD51/BRCA1与DSB共定位，回补αKG或肉碱恢复。ChIP?qPCR显示DSB位点γH2AX富集升高、H3K23ac/H4K8ac/H4K12ac及RAD51/BRCA1结合降低，回补后恢复。HR基因转录水平未变，排除转录调控。综上αKG–TMLHE–肉碱轴通过位点特异性组蛋白乙酰化促进HR?mediated DSB修复。

Carnitine predicts survival in patients（肉碱相关分子可预测患者生存）

高级别浆液性卵巢癌TMA中Cyclin E1与TMLHE蛋白表达正相关，TMLHE及Cyclin E1均与组蛋白H3ac/H4ac/H4K8ac/H4K12ac/H3K23ac正相关。复发患者肿瘤高TMLHE（H?score中位数分层）较TMLHE低者PFS更短（23 vs 38个月，HR=2.524，P=0.023）。新诊断患者高血清乙酰肉碱（上四分位）较低于下四分位PFS更差（中位未达 vs 23.4个月，HR=2.439，P=0.036），调整年龄分期后仍显著。小鼠CCNE1模型mildronate联合顺铂较单药显著降低瘤负荷，肿瘤乙酰肉碱降低但肝、血浆、腹水乙酰肉碱不受影响，小鼠体重维持正常。

讨论与结论总结

既往αKG被认为通过αKGDDs调控组蛋白/DNA去甲基化影响修复，本文首次报道αKG通过作为TMLHE（αKGDD）辅底物促进从头肉碱合成，肉碱经CrAT/CrOT介导的乙酰肉碱穿梭提供核内乙酰?CoA，驱动H3K23ac、H4K8ac、H4K12ac等位点特异性组蛋白乙酰化，染色质开放并招募RAD51/BRCA1促进HR介导DSB修复，该轴与ACLY途径非冗余。临床卵巢癌样本TMLHE高表达及高血清乙酰肉碱与组蛋白高乙酰化及更差PFS相关。药理学抑制肉碱合成（mildronate）或IDH1抑制可在HR?proficient、CCNE1/MYC高表达模型中使肿瘤对DNA损伤剂增敏。研究表明αKG除去甲基化功能外，还可通过代谢–表观耦合维持HR熟练性，为HR?proficient肿瘤提供了新的可靶向代谢弱点及潜在预测性生物标志物（TMLHE、血清乙酰肉碱）。