活性氧响应型硫缩酮-介孔二氧化硅纳米粒共递送柴胡皂苷D通过增强抗肿瘤免疫抑制结直肠癌肝转移

《Journal of Nanotechnology》：ROS-Responsive Thioketal–Mesoporous Silica Nanoparticles Codelivering Saikosaponin D Suppress Colorectal Cancer Liver Metastasis by Boosting Antitumor Immunity

背景：结直肠癌（CRC）是全球范围内高发的恶性肿瘤，常发生肝转移，是导致患者死亡的主要原因。当前治疗策略面临化疗耐药、疗效有限和毒副作用显著等挑战。柴胡皂苷D（SA）是一种从柴胡中提取的天然活性分子，显示出抗肿瘤、抗炎和免疫调节等潜力，但其疗效和机制尚不明确，亟需通过改进递送系统来增强其治疗效果。活性氧（ROS）响应型纳米药物递送平台因能在肿瘤微环境中特异性释药而备受关注。然而，将SA与ROS响应性连接子结合用于调节肿瘤免疫微环境的研究仍有限。本研究旨在开发一种新型纳米平台，以解决上述问题。
方法：研究人员制备了负载SA并修饰有ROS响应性硫缩酮（TK）连接子的介孔二氧化硅（MSN）纳米粒，即MSN–TK@SA。通过多种分析技术对纳米粒进行了表征，并评估了其药物释放特性。研究在CT-26结直肠癌细胞和结直肠癌肝转移伴肝郁气滞小鼠模型中进行，通过体内外实验评估了MSN–TK@SA的抗肿瘤活性、免疫调节作用及对肝转移的抑制效果。
结论：MSN–TK@SA纳米粒实现了高效药物负载、可控释放和免疫激活，显著抑制了结直肠癌肝转移。该纳米平台为药物递送和免疫治疗提供了一种有前景的策略，值得进一步开展临床前和转化研究。

结直肠癌（CRC）是胃肠道常见的侵袭性系统性癌症，全球发病率及死亡率均较高。转移是导致结直肠癌高死亡率的主要原因，其中肝转移最为常见。早期诊断的结直肠癌患者中约有四分之一已发生肝转移，超过半数的患者最终会因肝转移死亡。现有针对转移性结直肠癌的诊断和免疫治疗方法因化疗耐药、疗效低及毒副作用大而面临挑战。因此，开发新型治疗策略，尤其是基于纳米药物的策略，对于改善结直肠癌的系统性管理至关重要。柴胡皂苷D（SA）是从柴胡中分离的一种生物活性分子，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种药理活性，但其在癌症治疗中的具体疗效和机制尚不明确，且存在生物利用度低等问题。介孔二氧化硅纳米粒（MSN）作为药物递送载体，具有高比表面积、可调孔径和易于表面功能化等优点，是理想的药物载体。活性氧（ROS）响应型硫缩酮（TK）连接子能在正常生理条件下保持稳定，但在肿瘤微环境的高ROS水平下可被特异性裂解，从而实现药物的靶向释放，减少脱靶效应。因此，结合SA的治疗潜力与MSN–TK纳米平台的精准递送能力，有望开发出一种新型高效、低毒的抗结直肠癌肝转移药物。研究人员开展此项研究，旨在构建一种同时负载SA并修饰有ROS响应性TK连接子的介孔二氧化硅纳米粒（MSN–TK@SA），并通过系统评价其理化性质、体内外抗肿瘤效果及免疫调节作用，为治疗结直肠癌肝转移提供新的策略和实验依据。

为了开展研究，研究人员主要采用了以下几个关键技术方法：首先，通过氨基功能化、物理吸附和共价接枝等步骤制备了MSN–TK@SA纳米粒，并利用X射线衍射（XRD）、氮气吸附-脱附（BET）、透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、热重分析（TGA）、动态光散射（DLS）等技术对其进行了全面表征。其次，通过体外细胞实验评估了纳米粒对结直肠癌细胞（CT-26和Hepa1-6）活性、凋亡、迁移和侵袭的影响，主要使用CCK-8试剂盒、Calcein-AM/PI染色、Annexin V-FITC/PI流式细胞术以及Transwell小室实验。最后，建立了结直肠癌肝转移伴肝郁气滞的BALB/C裸鼠模型（样本来源为上海斯莱克实验动物中心），通过尾静脉注射纳米粒进行体内治疗，并综合运用组织病理学分析（H&E染色）、免疫荧光染色（Ki67、CD31）、TUNEL染色、酶联免疫吸附测定（ELISA）以及流式细胞术分析肿瘤微环境免疫细胞（CD8⁺CD4⁺ T细胞、CD11b⁺Gr-1⁺细胞）等方法评估其体内疗效、抗转移作用及免疫调节效应。

研究结果如下：
（1）MSN–TK@SA纳米粒的表征：多种分析技术证实，制备的MSN–TK@SA纳米粒呈球形、单分散、胶体稳定性良好。XRD显示其具有无定形二氧化硅结构。BET分析表明其具有有序介孔结构和高比表面积（365.45 m²/g）。TEM图像显示其形态均匀，尺寸约173 nm。FTIR证实了硅羟基、胺基和PEG-TK功能基团的存在。TGA分析显示其成功负载了有机药物和功能涂层。该纳米粒具有高包封率（81%）和载药率（29%）。体外释放实验显示，药物释放呈现持续/控制性特征，在72小时内释放约80%，无突释现象。释放动力学分析表明，其释放行为符合一级动力学和Weibull模型，属于浓度依赖性的扩散控制释放。在模拟肿瘤微环境的H₂O₂（1 mM）刺激下，药物释放速率显著加快。

（2）体外抗肿瘤活性：与单独的SA、MSN@SA以及对照组（PBS、MSN）相比，MSN–TK@SA在CT-26和Hepa1-6细胞中均显示出更强的抗肿瘤活性。具体表现为细胞存活率显著下降、活细胞比例降低、细胞凋亡率增加、迁移和侵袭能力受到明显抑制。细胞摄取实验证实MSN–TK@SA能被癌细胞有效内化。

（3）体内抑制肿瘤发生和肝转移并延长生存期：在结直肠癌肝转移小鼠模型中，MSN–TK@SA治疗显著延长了荷瘤小鼠的生存期。大体观察和组织病理学分析（H&E染色）表明，MSN–TK@SA治疗显著减小了原发肿瘤体积，减轻了肝脏和肺部的转移灶负荷及组织损伤。免疫荧光染色显示，MSN–TK@SA治疗显著降低了肿瘤组织中Ki67阳性细胞比例和CD31阳性微血管密度，同时增加了TUNEL阳性细胞比例，表明其能有效抑制肿瘤细胞增殖、血管生成并诱导细胞凋亡。ELISA检测显示，MSN–TK@SA治疗显著降低了促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。

（4）体内增强免疫应答：流式细胞术分析显示，与对照组和其他治疗组相比，MSN–TK@SA治疗显著增加了小鼠血液、肝脏和脾脏中CD8⁺CD4⁺ T细胞的比例，同时显著降低了CD11b⁺Gr-1⁺髓源性抑制细胞的数量。这表明MSN–TK@SA能够有效重塑肿瘤免疫微环境，激活抗肿瘤免疫并抑制免疫抑制状态。

（5）良好的体内生物相容性：对小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾）进行的H&E染色分析显示，MSN–TK@SA纳米粒治疗未引起明显的组织病理学改变，与对照组相似，表明其具有良好的生物相容性。

讨论部分总结了研究的主要发现和意义。研究成功制备了MSN–TK@SA纳米粒，其具有均一的粒径和形貌，能有效负载TK和SA，并实现治疗药物的高效包封和可控释放。在所有配方（SA、MSN@SA、MSN–TK@SA）中，MSN–TK@SA在抑制结直肠癌细胞增殖和肝转移、激活体内免疫应答（表现为CD8⁺/CD4⁺ T细胞比例增加和CD11b⁺Gr-1⁺细胞减少）以及延长肝转移小鼠生存期方面最为有效。体内安全性研究证实了纳米粒的生物相容性，表明其具有生物医学应用潜力。研究指出，MSN–TK@SA结合了SA的治疗作用与TK的ROS响应性释药特性，实现了靶向治疗并增强了疗效。SA本身具有抗炎和抗氧化应激特性，其与TK的联合可能协同增强了对转移的抑制作用。该研究为开发基于天然产物的新型免疫调节纳米药物提供了新思路。

研究结论如下：本研究探讨了新开发的MSN–TK@SA纳米粒对结直肠癌肝转移的影响，发现其具有实用性和有效性。MSN–TK@SA纳米粒能够实现高效的药物负载、可控释放和免疫激活，显著抑制了结直肠癌肝转移。这些免疫学效应（如CD8⁺/CD4⁺ T细胞浸润增加和CD11b⁺Gr-1⁺抑制细胞减少）导致了生存期的延长和肝脏转移的减少。总体而言，该设计独特地将氧化还原敏感性递送与免疫刺激相结合，为治疗结直肠癌肝转移提供了一种有前景的疗法。