《Scientia Horticulturae》：Differences in powdery mildew resistance and associated miRNA expression in cucumber grafted onto contrasting rootstocks
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在黄瓜中，砧木显著影响接穗对白粉病的抗性；然而，由不同砧木诱导的抗性差异及其潜在的调控机制仍知之甚少。本研究中，黄瓜品种‘新泰密刺’作为接穗，分别嫁接到南瓜砧木‘nd8’（抗性）和‘nd4’（感性）上，形成抗性组合（C/R）和感性组合（C/S），以自嫁接植株（
在黄瓜中，砧木显著影响接穗对白粉病的抗性；然而，由不同砧木诱导的抗性差异及其潜在的调控机制仍知之甚少。本研究中，黄瓜品种‘新泰密刺’作为接穗，分别嫁接到南瓜砧木‘nd8’（抗性）和‘nd4’（感性）上，形成抗性组合（C/R）和感性组合（C/S），以自嫁接植株（C/C）作为对照。在接种白粉病后，系统分析了抗病性、生理反应和miRNA表达谱。与C/C相比，C/R的病情指数降低了63.17%，而C/S仅略有降低（9.65%），表明砧木依赖性对接穗抗性产生显著差异。与此一致，C/R植株表现出显著增强的抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性和苯丙烷代谢相关关键酶活性，同时有效缓解了膜脂过氧化。相比之下，C/S植株表现出有限的防御相关酶活性激活，并遭受了加剧的氧化损伤。在接种后48小时，共鉴定了209个miRNA。差异表达的miRNA主要分布在C/R特有miRNA（28%）、在所有嫁接组合中共享的miRNA（14%）以及在C/R和C/S之间共享的miRNA（3.5%）。靶基因分析表明，这些miRNA主要调控激素相关转录因子、信号转导组分、防御代谢相关基因以及与膜稳态相关的基因。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进一步证实，miR156c-5p–SPL13、miR169f-5p–BAK1和miR172a-3p–RAP2–7/SCD1模块在C/R和C/S之间表现出相反的调控模式。这些结果表明，砧木基因型通过协调的生理和miRNA介导的调控塑造了接穗抗性，为嫁接诱导的抗病性和分子育种提供了潜在靶点。
黄瓜是中国最重要的温室蔬菜之一，但其生产极易受到白粉病的影响，可导致10%-40%的产量损失。在商业生产中，将优良黄瓜品种嫁接到抗病砧木上是提高产量和增强抗性的有效策略。研究人员前期的研究已证实不同嫁接组合之间存在显著的抗性差异，且接穗的抗性主要由砧木决定。因此，阐明砧木如何调控接穗抗性已成为基于嫁接栽培系统中的一个关键科学问题。
随着分子生物学的发展，砧木对接穗抗性的影响已从生理过程——如养分供应和抗氧化调节——延伸到涉及信号转导和抗性基因调控的分子机制。在这些机制中，miRNA介导的转录后调控已成为植物免疫的重要组成部分。越来越多的证据表明，砧木可以改变接穗miRNA及其靶基因的表达模式，从而影响植物发育、代谢和胁迫适应。在非生物胁迫下，砧木调控的miRNA的作用已被广泛记录。然而，砧木调控的miRNA在生物胁迫——特别是白粉病——下的功能在很大程度上尚未被探索。尽管白粉病侵染已被证明可触发黄瓜中miRNA-靶基因的重编程，但目前仍缺乏系统证据证明砧木是否通过重塑miRNA调控网络来调节接穗免疫力。为填补这一空白，研究人员使用两个近等基因系南瓜品系‘nd8’（抗性）和‘nd4’（感性）作为砧木，生成了三种嫁接组合。通过整合抗性表现、病原侵染前后的生理反应以及关键时间点的miRNA表达谱，鉴定了差异表达的miRNA，并通过qRT-PCR验证了其表达动态和靶标关系。基于这些结果，构建了与嫁接诱导抗性分化相关的miRNA-mRNA调控网络。这项研究旨在阐明不同砧木塑造黄瓜白粉病抗性的机制，为抗性砧木育种和提升黄瓜生产品质提供分子见解。
研究人员采用的关键技术方法包括：以抗性差异显著的南瓜砧木‘nd8’与‘nd4’及黄瓜接穗‘新泰密刺’构建三种嫁接组合（C/C、C/R、C/S）。通过接种白粉菌（Sphaerotheca fuliginea），结合病害指数、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、苯丙烷代谢关键酶（C4H）活性及丙二醛（MDA）含量等指标进行抗性与生理响应评估。在关键时间点（48小时）取样进行小RNA（sRNA）测序，利用生物信息学方法分析差异表达miRNA及其靶基因功能，并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对关键miRNA-靶基因模块进行验证。
研究结果分析如下：
首先，不同砧木嫁接组合的黄瓜幼苗对白粉病表现出不同的生理响应。研究人员通过评估接种后5天的病情指数和发病率，发现C/R组合的病情指数和发病率较C/C分别显著降低了63.17%和37.94%，表现为抗性；而C/S组合仅略有降低，仍表现为感性，表明砧木抗性对接穗抗性起主要影响。进一步生理分析显示，C/R植株在侵染后苯丙烷代谢关键酶C4H活性迅速升高，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性显著高于C/C和C/S，且膜脂过氧化产物MDA含量保持稳定。相比之下，C/S植株的防御酶活性激活有限，MDA含量显著积累，表明遭受了更严重的氧化损伤。这些结果表明，抗性砧木通过增强抗氧化系统和苯丙烷代谢来共同支撑接穗的抗性。
其次，sRNA测序分析揭示了嫁接组合间miRNA表达模式的显著差异。在接种后48小时，共鉴定出209个miRNA。差异表达miRNA的分析显示，C/R特有的差异miRNA占比最高（28%），其次是所有嫁接组合共享的miRNA（14%），以及C/R与C/S共享的miRNA（3.5%）。这表明砧木类型显著影响接穗对白粉病的miRNA响应。值得注意的是，尽管C/C和C/S的表型病情指数相似，但其差异miRNA表达模式和靶基因调控存在实质差异，提示相似的表型结果可能源于不同的分子调控机制。
第三，针对差异表达miRNA靶基因的GO和KEGG功能分析，明确了其潜在的调控功能。三种嫁接组合共享一些核心防御相关的GO富集项，如“细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性调节”等。C/R组合特有富集在氨基酸生物合成、磷脂结合以及植物激素信号转导（油菜素内酯）、淀粉和蔗糖代谢、内吞作用等通路，提示其参与氨基酸代谢、蛋白质合成和膜脂动态调节。而C/S组合则富集在核酸结合、磷酸肌醇信号系统等通路，C/C组合则富集于光合作用抑制及苯丙烷生物合成、植物激素信号转导（生长素）等防御与能量重编程通路。基于此，构建了一个以激素相关转录因子（如SPL、AP2）、信号转导组分（如BAK1）、防御代谢基因（如MAN6、CYP78A5）及膜稳态相关基因（如ATG9）为核心的miRNA-mRNA调控网络。
第四，通过qRT-PCR对关键差异表达miRNA及其靶基因进行了验证。结果表明，miR169f-5p、miR156c-5p和miR172a-3p在C/C和C/S中随病害发展呈上调趋势，而在C/R中显著下调，与测序结果一致。进一步分析其靶基因发现，miR156c-5p的靶标SPL13在C/R中表达量显著升高，而miR169f-5p的靶标BAK1在C/R中于72小时显著上调，miR172a-3p的靶标RAP2–7在C/R中表达量最低。这些结果证实了miR156c-5p–SPL13、miR169f-5p–BAK1和miR172a-3p–RAP2–7/SCD1模块在抗性砧木与感性砧木诱导的接穗抗性差异中起关键作用。
讨论部分综合分析认为，本研究系统揭示了不同抗性砧木嫁接的黄瓜在白粉病侵染下的表型、生理和分子层面的响应差异。抗性砧木（‘nd8’）能够显著增强接穗的抗氧化能力、激活苯丙烷代谢并调控特定的miRNA表达谱，从而有效抵御病原侵染。而感性砧木（‘nd4’）的调控效果有限，导致接穗遭受严重氧化损伤。研究最核心的发现是，鉴定出三个关键的miRNA-靶基因调控模块（miR156c-5p–SPL13、miR169f-5p–BAK1、miR172a-3p–RAP2–7/SCD1），它们在抗性和感性砧木嫁接组合中表现出相反的表达模式。这表明砧木基因型可能通过调控这些模块，进而影响茉莉酸（JA）信号、活性氧（ROS）稳态、模式触发免疫（PTI）以及乙烯介导的防御反应等过程，最终塑造接穗的抗病性。此外，研究指出相似的表型抗性（如C/C和C/S）可能源自不同的分子调控策略，强调了整合分子数据与传统表型分析的必要性。这项研究不仅为砧木介导的黄瓜抗病分子机制提供了新见解，也为通过砧木选择或分子育种改良抗病性提供了潜在靶点。
本研究揭示了嫁接到对比砧木上的黄瓜在白粉病抗性及miRNA表达方面存在显著差异。抗性砧木嫁接组合（C/R）显著增强了接穗的抗氧化酶活性和苯丙烷代谢，并有效抑制了膜脂过氧化；而感性砧木嫁接组合（C/S）的防御相关酶激活有限，并遭受了加剧的氧化损伤。接种后48小时，差异表达的miRNA在砧木特异性和共享类型间呈现不同的分布模式，其靶基因主要涉及激素相关转录因子、信号转导、防御代谢和膜稳态。此外，qRT-PCR验证确定miR156c-5p–SPL13、miR169f-5p–BAK1和miR172a-3p–RAP2–7/SCD1模块是与砧木诱导的接穗抗性差异相关的关键调控组分。这些发现为理解嫁接调控的黄瓜抗病分子机制提供了新的见解，并强调了在嫁接研究中整合生理学和miRNA分析的重要性。此外，所鉴定的miRNA-靶标模块为通过砧木选择或分子育种策略提高抗病性提供了潜在的候选靶标。
