通过策略性可激活PEG化肽克服肿瘤微环境中小细胞外囊泡介导的免疫学屏障

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Combating small extracellular vesicle–mediated immunological barriers in the tumor microenvironment via strategically activatable PEGylated peptides

　　

肿瘤细胞来源的小细胞外囊泡（tumor cell-derived small extracellular vesicles，TDEs）在免疫逃逸中发挥关键作用，包括建立免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），并构成癌症免疫治疗有效实施的重要屏障。研究人员在此提出ExoPERM（pH-enabled rupture of exosome membranes）策略，这是一种基于可破坏小细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）膜的α-螺旋肽的pH响应系统，可选择性靶向定位于TME内的小EV。通过引入PEG化（PEGylation）的pH敏感连接臂，该系统在保证全身循环稳定性的同时，允许肽在轻度酸性的TME内选择性释放。机制研究显示，该肽在pH 6.5条件下优先破裂小EV，有效阻断EV上的PD-L1与CD8⁺ T细胞上PD-1的相互作用，并促进其效应功能恢复。此外，这种靶向性破坏显著减弱了TDE诱导的癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）活化，从而重塑了对免疫细胞浸润形成物理限制的致密纤维化基质。体内研究表明，该策略增强了CD8⁺ T细胞对肿瘤的浸润和激活，尤其是在与免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）或过继性T细胞转移（adoptive T-cell transfer，ACT）联用时更为显著。这些协同效应已在小鼠黑色素瘤和结直肠癌模型中得到稳健验证，成功将免疫学“冷肿瘤”转化为T细胞炎症型“热肿瘤”。ExoPERM策略为克服癌症中TDE介导的耐受提供了一种有前景的选择，并提示了一种不同于既有途径的小EV抑制方法。

该研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，聚焦于肿瘤来源小细胞外囊泡（TDEs）介导的免疫逃逸及其对免疫治疗耐受的促进作用。与传统化疗相比，免疫治疗显著改善了部分肿瘤患者的长期生存，但免疫检查点阻断（ICB）和过继性T细胞转移（ACT）在大量患者中疗效有限，核心原因之一在于肿瘤微环境（TME）的免疫抑制性。TDEs作为TME中重要的细胞间通讯载体，可通过外泌体PD-L1（exoPD-L1）抑制CD8⁺ T细胞功能，还能激活癌相关成纤维细胞（CAFs），形成致密纤维化基质，进一步阻碍效应T细胞浸润。因此，如何在不广泛干扰正常细胞外囊泡生物发生的前提下，选择性削弱TDEs的促肿瘤功能，成为当前肿瘤免疫治疗中的关键难题。基于此前开发的可按膜曲率识别并破坏50–150 nm脂双层囊泡的α-螺旋肽AH-Pep，研究人员进一步构建了具有肿瘤微环境酸响应特性的策略性可激活PEG化肽PEG-SA-Pep，并提出ExoPERM策略，旨在实现系统给药条件下对TME内免疫抑制性小EV的选择性破坏。

从研究设计看，研究人员的目标并非直接杀伤肿瘤细胞，而是通过解除TDE介导的双重屏障——免疫抑制与纤维化基质障碍——提升既有免疫治疗的响应性。结果表明，PEG-SA-Pep在生理条件下保持稳定，在轻度酸性TME中经pH敏感连接臂裂解释放活性AH-Pep，从而实现对小EV的局部破坏。该过程可抑制exoPD-L1与PD-1结合，缓解CD8⁺ T细胞耗竭，恢复其增殖与细胞毒功能；同时，PEG-SA-Pep还能抑制TDE诱导的CAF活化，降低α-SMA相关纤维化表型，改善T细胞进入肿瘤深部的空间可及性。基于这些作用，PEG-SA-Pep分别与aPD-1和ACT联用，在黑色素瘤与结直肠癌模型中均显示出明显优于单药方案的抗肿瘤活性，提示该策略可将免疫学“冷肿瘤”重塑为更有利于T细胞应答的“热肿瘤”。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究人员首先通过化学合成构建PEG-SA-Pep与非响应性对照PEG-NA-Pep，并用¹H NMR、高效液相色谱（HPLC）、MALDI–TOF质谱和圆二色谱（CD）进行结构表征；随后利用纳米颗粒追踪分析（NTA）、ELISA、共聚焦显微镜和流式细胞术，在B16F10来源TDEs及小鼠脾源CD8⁺ T细胞体系中评估囊泡破坏、PD-1/PD-L1结合与T细胞耗竭；体内部分采用B16F10黑色素瘤C57BL/6模型和CT26结直肠癌BALB/c模型，通过药代与生物分布分析、肿瘤浸润淋巴细胞检测、脾细胞再刺激实验、免疫荧光及ACT评估治疗效果，其中ACT供体细胞来源于CT26荷瘤小鼠的肿瘤引流淋巴结（TDLNs）。

以下为研究结果的主体解读。

Synthesis and characterization of PEG-SA-pep
研究人员首先围绕AH-Pep的系统给药可行性开展分子设计，构建了两种PEG化变体：具有pH响应性的PEG-SA-Pep，以及缺乏酸敏激活能力的对照分子PEG-NA-Pep。PEG-SA-Pep在PEG与肽之间引入carboxy-dimethyl maleic anhydride（CDM）连接臂，使其在TME典型的pH 6.5–6.8条件下发生水解，释放AH-Pep；而PEG-NA-Pep则通过稳定酰胺键连接，不具备pH响应性。HPLC与MALDI–TOF证实偶联成功，圆二色谱结果显示两种PEG化修饰后肽仍保持AH-Pep特征性α-螺旋构象。进一步释放实验表明，PEG-SA-Pep在pH 6.5下24 h释放量约为中性条件的3倍，而PEG-NA-Pep在不同pH条件下均几乎不释放，说明该体系确实具备面向TME的酸响应激活特征。

In vitro pH-responsive disruption of TDEs and restoration of T-cell function
在体外功能层面，研究人员从B16F10细胞培养上清中分离TDEs，并确认其粒径约147 nm，同时表达CD9和PD-L1。NTA结果显示，PEG-SA-Pep在pH 6.5条件下可显著破坏TDEs，效果接近裸AH-Pep，而PEG-NA-Pep几乎无明显作用，表明PEG屏蔽确实降低了肽与囊泡膜的相互作用，只有在酸敏裂解释放后才能恢复活性。机制上，TDEs完整存在时可促进PD-1与exoPD-L1结合，PEG-SA-Pep在酸性条件下显著削弱这一结合，而在pH 7.4下影响很小，提示该作用具有良好的环境选择性。共聚焦成像与流式结果进一步证明，经PEG-SA-Pep预处理的TDEs与CD8⁺ T细胞的关联明显减少。功能上，TDEs会抑制CD8⁺ T细胞Ki-67和Granzyme B（GrB）表达，诱导PD-1与LAG-3等耗竭表型；PEG-SA-Pep在pH 6.5条件下可明显逆转这种抑制，恢复T细胞增殖和效应分子表达。由此可见，ExoPERM策略在体外可通过破坏TDEs并削弱exoPD-L1信号，缓解T细胞功能衰竭。

In vivo pharmacokinetics and biodistribution of PEG-SA-Pep
为了验证系统给药基础，研究人员比较了裸AH-Pep与两种PEG化肽的稳定性和体内行为。血清稳定性试验显示，AH-Pep迅速降解，而PEG-NA-Pep和PEG-SA-Pep在48 h内均保持较高稳定性，表明PEG化有效提高了抗蛋白水解能力。体内药代和生物分布研究发现，PEG-SA-Pep在肿瘤中的富集明显优于AH-Pep和PEG-NA-Pep，肿瘤AUC分别提高3.14倍和1.96倍，并在注射后6 h达到峰值。相比之下，AH-Pep更多分布于肝肾，提示快速清除。进一步在B16F10荷瘤小鼠中检测循环exoPD-L1，结果显示AH-Pep和PEG-NA-Pep均难以显著降低其水平，而PEG-SA-Pep可呈剂量依赖性降低血浆exoPD-L1，在15 mg/kg时可将其降至接近无瘤小鼠水平。这说明PEG-SA-Pep不仅提高了肿瘤定位能力，还在体内具备清除免疫抑制性小EV的实际效力。

In vivo therapeutic efficacy of PEG-SA-Pep in combination with ICB
在B16F10黑色素瘤模型中，研究人员评估了PEG-SA-Pep与抗PD-1抗体联用的治疗潜力。单用PEG-SA-Pep、PEG-NA-Pep或AH-Pep均未产生显著抑瘤效果，提示单纯去除TDEs不足以直接控制肿瘤生长。与之形成鲜明对比的是，PEG-SA-Pep联合aPD-1产生了显著协同效应，肿瘤生长抑制明显优于aPD-1单药及其他联用组，终点肿瘤重量和体积均显著下降。该结果说明，只有具备TME酸响应激活与局部小EV破坏能力的PEG-SA-Pep，才能真正增强ICB疗效。免疫机制分析显示，该联用方案显著提高了肿瘤内CD8⁺ T细胞浸润频率，降低了CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Tregs）比例，并下调CD8⁺ T细胞PD-1和LAG-3表达，提示TME由抑制状态向炎症型抗肿瘤状态重编程。脾细胞经GP100再刺激后的Ki-67增殖反应增强，则进一步证明该局部免疫重塑伴随系统性肿瘤特异性免疫应答增强。值得注意的是，总EV水平仅轻度下降，而肿瘤相关exoPD-L1显著减少，提示该策略具有一定选择性而非广泛性囊泡耗竭。

In vivo therapeutic efficacy of PEG-SA-Pep in combination with ACT
除T细胞活化外，ACT疗效还依赖于效应细胞能否有效进入肿瘤实质。研究人员因此在CT26结直肠癌模型中考察PEG-SA-Pep对T细胞浸润和纤维化基质的影响。免疫荧光显示，经PBS、AH-Pep或PEG-NA-Pep处理后，过继转移的T细胞主要滞留于肿瘤边缘，难以深入肿瘤核心；而PEG-SA-Pep预处理可显著增加肿瘤内部T细胞荧光信号，提示其改善了T细胞在TME中的空间分布。结合既往关于TDEs促进CAF活化和纤维化形成的认识，研究人员进一步在NIH3T3成纤维细胞中证实，TDEs可诱导α-SMA上调，而PEG-SA-Pep在pH 6.5条件下能有效阻断这一过程。体内结果同样显示，PEG-SA-Pep可使肿瘤组织α-SMA水平下降约75%，而AH-Pep和PEG-NA-Pep无显著影响，说明其能够缓解TDE介导的纤维化基质重塑。最终在ACT治疗实验中，单纯ACT即使联合IL-12也仅产生有限抑瘤效果，AH-Pep或PEG-NA-Pep预处理也未改善疗效；唯有PEG-SA-Pep预处理可持续延缓肿瘤进展，提示其通过削弱物理屏障和免疫抑制双重因素，提高了ACT在实体瘤中的治疗效率。

讨论部分显示，该研究的核心创新在于避开了对小EV生物发生途径的普遍性抑制，而是采用面向TME酸性环境的外源性、可激活小EV膜破坏策略。作者强调，ExoPERM的选择性主要来自环境限制而非细胞来源特异性，即该策略在肿瘤生态位内作用于富集的免疫抑制性小EV群体，包括TDEs以及部分源自基质或免疫细胞的小EV。其优势在于：一方面，通过PEG化提升了循环稳定性和体内递送性能；另一方面，通过酸敏连接臂保证了活性在肿瘤局部释放，减少了非靶组织暴露。此外，AH-Pep对高膜曲率小囊泡的偏好也进一步增强了其对小EV的功能选择性。研究同时指出，目前该平台尚未实现严格的TDE来源特异性区分，未来可通过引入TDE靶向基序进一步提高精准性，并需在更广泛的临床相关肿瘤类型中验证通用性。

研究结论部分可译为：本研究建立了ExoPERM策略，这是一种用于在肿瘤微环境内选择性破坏包括TDEs在内的免疫抑制性细胞外囊泡（EVs）的pH响应性方法。以PEG-SA-Pep作为代表性实现形式，研究结果证明ExoPERM策略能够中和exoPD-L1，同时保留正常细胞功能，从而提供了一种在机制上区别于非特异性生物发生抑制剂、且潜在更安全的替代方案。该策略克服了癌症免疫治疗中的两大障碍：其一是限制ICB疗效的免疫抑制，其二是限制ACT的纤维化基质。通过同时解决这两方面问题，该策略促进免疫学冷肿瘤向T细胞炎症型热肿瘤转化。其模块化设计允许连接臂、治疗负载及联合治疗伙伴的灵活变更，支持其广泛适配并整合至既有治疗方案中。鉴于抗体类和细胞类免疫治疗近期均取得临床进展，类似ExoPERM这样可增强T细胞浸润与功能的策略，有望扩大现有治疗的获益范围，尤其适用于对现有治疗模式耐受的肿瘤。