基于磷酸化蛋白质组学区分人类磷蛋白酶（PLN）心肌病的疾病特异性机制及其RNA疗法可逆性

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Phosphoproteomics distinguishes disease-specific mechanisms for human phospholamban cardiomyopathy reversible by RNA therapy

　　

**摘要翻译**：磷蛋白酶（PLN）p.Arg14del（R14Δ/+，亦称R14del）是一种导致遗传性心肌病的致病变异。RNA疗法能够改善小鼠PLN R14Δ/+模型的心功能及生存率。然而，该变异在人类环境中的分子疾病机制及RNA疗法的潜在治疗效果仍不明确。研究人员对R14Δ/+患者（N = 6）的心脏组织进行了蛋白质组学及磷酸化蛋白质组学分析，并与其它病因所致的扩张型心肌病（DCM; N = 10）进行了比较。研究结果在CRISPR-Cas9工程化构建的R14Δ/+诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）及其等基因对照中得到验证。为评估可逆性，研究人员在iPSC-CMs上应用了基于反义寡核苷酸的PLN靶向RNA疗法。蛋白质组学分析揭示了纤维化通路的富集，而磷酸化蛋白质组学则突出显示了肌动球蛋白结构组织方面的改变，这构成了区分R14Δ/+与其它DCM的独特标志。该磷酸化蛋白质组学特征在R14Δ/+ iPSC-CMs中得到重现。RNA疗法以浓度依赖的方式降低了PLN表达并改变了疾病特异性的磷酸化谱。在患者组织和iPSC-CMs中，有28个磷酸化位点发生了持续性改变；其中22个在RNA疗法后发生逆转，且这些位点富集于钙粘蛋白及肌动蛋白结合功能，提示细胞骨架重塑。PLN/LC3蛋白聚集体——PLN心肌病的标志性特征——在RNA疗法后减少。功能上，R14Δ/+心肌细胞表现出加速的钙处理和收缩动力学，而RNA疗法进一步增强了这些特性。人类PLN R14Δ/+心肌病的特征在于一个涉及细胞骨架和收缩机制的独特磷酸化蛋白质组学特征。PLN靶向RNA疗法降低了PLN表达，部分正常化了这些改变，减少了蛋白质聚集，并增强了钙处理与收缩性能。这些发现阐明了R14Δ/+发病的分子机制，并支持RNA疗法作为一种治疗PLN心肌病的前景性策略。

**论文解读**：遗传性心肌病，如PLN R14Δ/+突变所致者，是导致心力衰竭和心脏性猝死的主要原因，目前缺乏靶向治疗手段。PLN是心肌收缩力的关键调节因子，通过抑制肌浆/内质网钙离子-ATP酶2a（SERCA2a）介导的钙离子重摄取发挥作用。PLN R14Δ/+变异引起扩张型和心律失常性心肌病，其临床表现和进展具有显著异质性。尽管其临床严重性高，标准的心力衰竭治疗获益有限。在细胞水平，该心肌病以收缩力受损、代谢失调和钙处理缺陷为特征，并伴有肌浆网相关的PLN聚集。然而，将PLN R14Δ/+变异与下游细胞功能障碍联系起来的分子机制仍不完全清楚。值得注意的是，疾病表型表现出高度的物种依赖性，这凸显了研究人类患者来源材料以解析临床相关机制的重要性。RNA测序和全局蛋白质组学常作为定义分子疾病特征的起点，但两者均无法捕获翻译后调控，而这通常是细胞控制的即时且功能上决定性的层面。翻译后修饰，尤其是磷酸化，能够对细胞功能进行快速可逆的调节。在心肌细胞中，兴奋-收缩耦联以每一次搏动为基础运作，这种动态调控对维持收缩性能和适应生理应激至关重要。因此，直接评估翻译后调控机制的方法是必要的。磷酸化蛋白质组学提供了一种互补方法，通过直接量化调节心肌细胞收缩、代谢和细胞骨架动态的磷酸化事件来发挥作用。整合磷酸化蛋白质组学与全局蛋白质组学，为揭示仅靠转录组学或蛋白质组学无法检测到的疾病特异性信号改变提供了强有力的策略。近期，RNA疗法作为一种心血管疾病的治疗平台开始兴起，并已在高胆固醇血症、肌营养不良和转甲状腺素蛋白淀粉样变性病中获得临床验证的成功。这些疗法能够选择性抑制致病性mRNA，代表了针对心肌病致病变异进行靶向治疗的一种前景策略。既往研究表明，使用PLN反义寡核苷酸（PLN-ASOs）的PLN靶向RNA疗法改善了PLN R14Δ/+小鼠模型的心功能和生存率。然而，RNA疗法具有固有的物种特异性，且PLN R14Δ/+变异的效应具有高度的模型特异性，因此需要在人类模型中进行验证。本研究旨在通过整合患者心肌组织、磷酸化蛋白质组学和人类iPSC-CM建模，解析R14Δ/+变异如何改变心肌细胞信号传导，并评估PLN靶向RNA疗法的治疗潜力。患者心肌组织被用作主要的发现平台，而iPSC-CMs则作为一个受控系统，用于探究患者定义的信号改变是否能在心肌细胞水平上重现并被调节。研究结论指出，PLN R14Δ/+心肌病的特征在于一个涉及细胞骨架重塑、收缩性、钙处理和信号传导的独特磷酸化蛋白质组学特征，这些改变仅靠蛋白质组学无法检测。磷酸化蛋白质组学因此成为连接致病变异与改变的钙处理、结构重塑及心肌细胞功能障碍的关键层。RNA疗法部分逆转了这种分子谱，恢复了细胞骨架磷酸化模式，增强了钙和收缩动力学，并减少了PLN聚集。与替代性治疗方法相比，RNA疗法产生了更广泛、更整合的效应，使其成为迄今为止治疗R14Δ/+心肌病最有前景的策略。这一整合方法展示了磷酸化蛋白质组学如何加速遗传性心肌病的机制洞察和治疗开发。

本研究采用的主要技术方法包括：利用患者心脏组织（在左心室辅助装置植入术中获取）和CRISPR-Cas9工程化构建的R14Δ/+ iPSC-CMs模型；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行全局蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析；应用基于反义寡核苷酸的PLN靶向RNA疗法；以及通过钙离子成像、收缩力分析和免疫荧光染色进行功能验证。

研究结果部分首先题为“PLN R14Δ/+患者心脏组织显示出独特的、磷酸化驱动的疾病特征”。通过对患者左心室样本的蛋白质组学分析发现，与其它DCM相比，R14Δ/+患者组织中有246种差异表达蛋白（DEPs），主要富集于细胞外基质组织和胶原纤维形成等纤维化相关通路。磷酸化蛋白质组学分析则揭示了更广泛的分子足迹，鉴定出740个蛋白上的1507个差异表达磷酸化位点（DEPSs），其最显著富集的通路为肌动蛋白结构组织和心肌收缩调节，直接关联到细胞骨架完整性、收缩功能和钙响应信号。这提示了兴奋-收缩耦联受损和细胞骨架重塑。

其次题为“磷酸化蛋白质组学疾病特征在R14Δ/+ iPSC-CMs中得到重现”。在CRISPR-Cas9工程化的R14Δ/+ iPSC-CMs中，蛋白质组学发现445个DEPs，主要富集于糖酵解和GTP酶信号通路。磷酸化蛋白质组学同样揭示了更广泛的改变，鉴定出1757个DEPSs，富集于染色质组织、肌动蛋白结构组织和心脏传导调节等通路。关键收缩和钙处理蛋白的差异磷酸化模式与患者组织中检测到的细胞骨架和收缩异常相呼应，证明了该磷酸化特征是变异驱动的，并可在细胞模型中重现。

接着题为“RNA疗法逆转与细胞骨架组织相关的疾病相关磷酸化改变”。对R14Δ/+ iPSC-CMs进行PLN靶向RNA疗法处理后，RNA疗法以剂量依赖的方式降低了PLN的mRNA和蛋白水平。磷酸化蛋白质组学揭示了广泛的治疗效应，鉴定出614个DEPSs，富集于转录调控、钙处理和收缩功能等通路。跨患者心肌、iPSC-CMs和RNA治疗细胞的整合分析，识别出28个持续改变的磷酸化位点，其中22个在疾病状态和RNA治疗之间受到相反调节，并富集于钙粘蛋白和肌动蛋白结合蛋白，强调了恢复细胞骨架信号是RNA疗法的核心效应。

最后题为“磷酸化蛋白质组学谱预测的表型在细胞水平得到验证及治疗逆转”。功能实验证实，与等基因对照相比，R14Δ/+ iPSC-CMs表现出持续加速的钙瞬变和缩短的收缩-舒张动力学，这与兴奋-收缩耦联受损的预测一致，并伴有核周PLN/LC3聚集簇的形成。PLN靶向RNA疗法减轻了这些异常，增强了钙动力学，恢复了收缩幅度，并减少了PLN/LC3聚集体，证明了聚集表型的挽救。

讨论部分总结指出，本研究整合了多层次策略，结合患者心肌组织、磷酸化蛋白质组学和人类iPSC-CM建模，解析了R14Δ/+变异如何改变心肌细胞信号传导，并评估了PLN靶向RNA疗法的治疗潜力。研究结果证明，磷酸化蛋白质组学（而非蛋白质丰度本身）是揭示驱动R14Δ/+疾病调控通路所必需的。观察到的磷酸化改变被解释为改变的钙处理及相关的钙响应激酶和磷酸酶信号重塑的下游后果，而非主要的疾病驱动因素。本研究首次在人类模型中证明了PLN靶向RNA疗法能够改善遗传性心肌病的分子、结构和功能表型。尽管完全丧失PLN可能导致扩张型心肌病，但数据显示出一种生物反应性，即部分PLN减少增强了钙和收缩性能并减少了蛋白质聚集，而没有明显毒性。这些结果支持推进PLN靶向RNA疗法进入临床试验（ClinicalTrials.gov ID: NCT07241104），并为将RNA疗法应用于其他遗传性心肌病形式建立了一个框架。综上所述，PLN R14Δ/+心肌病的特征在于一个涉及细胞骨架重塑、收缩性、钙处理和信号传导的独特磷酸化蛋白质组学特征，这些改变仅靠蛋白质组学无法检测。因此，磷酸化蛋白质组学在连接致病变异与改变的钙处理、结构重塑及心肌细胞功能障碍方面发挥着至关重要的作用。RNA疗法部分逆转了这种分子谱，恢复了细胞骨架磷酸化模式，增强了钙和收缩动力学，并减少了PLN聚集。与替代性治疗方法相比，RNA疗法产生了更广泛、更整合的效应，确立了其作为治疗R14Δ/+心肌病迄今为止最有前景的策略。这一整合方法展示了磷酸化蛋白质组学如何加速遗传性心肌病的机制洞察和治疗开发。