LISS（lncRNA of IFN-γ-signaling suppressor）介导结直肠癌免疫逃逸且不依赖于微卫星不稳定性（MSI）状态

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：LISS enables immune evasion of colorectal cancers irrespective of MSI status

尽管免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）疗法被誉为癌症治疗的重大进展，但在结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）中仍未取得理想疗效——约85%的微卫星稳定（MicroSatellite Stable, MSS）病例及约50%的微卫星不稳定（MicroSatellite Instability, MSI）病例对ICB无应答。如何改善CRC的ICB疗效尚不清楚。本研究鉴定出一个新型免疫调节长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）基因，命名为IFN-γ信号抑制因子lncRNA（lncRNA of IFN-γ-signaling suppressor, LISS）。LISS在CRC中高表达，与患者不良预后及高CD8+评分相关。功能研究表明LISS削弱T细胞介导的细胞毒性，且不依赖MSS/MSI状态。机制上，LISS通过其含两个独立RNA茎环的微区直接与钙调蛋白依赖性激酶IIγ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II γ, CamKIIγ）的激酶调节结构域结合，阻止CamKIIγ与其底物信号转导及转录激活因子1（Signal Transducer and Activator of Transcription 1, STAT1）结合及催化STAT1丝氨酸（Serine, S）727位磷酸化（pS-STAT1），而pS727-STAT1是STAT1最优活化及后续主要组织相容性复合体I类（Major Histocompatibility Complex class I, MHC-I）基因表达所必需。人CRC组织分析显示LISS与pS-STAT1或MHC-I呈显著负相关。肠上皮LISS敲入促进Apcmin/+小鼠腺瘤发生。LISS反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotide, ASO）体内治疗可通过恢复MHC-I表达增强MSS及MSI型CRC对ICB的响应。因此，本研究鉴定出此前未被表征的、作为T细胞免疫调节因子的lncRNA LISS，靶向LISS可能是改善不同MSI特征CRC患者ICB疗效的有效策略。

《Signal Transduction and Targeted Therapy》刊发研究解读：LISS介导结直肠癌免疫逃逸且不依赖MSI状态

本研究针对结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）响应率低——包括约85%微卫星稳定（MicroSatellite Stable, MSS）型CRC原发耐药及约50%微卫星不稳定（MicroSatellite Instability, MSI）型CRC原发或继发耐药——这一临床难题展开。现有认知认为MSS型CRC因肿瘤突变负荷低、新抗原少而对ICB不敏感，但MSI型CRC虽具高突变负荷仍有半数无响应，提示存在不依赖于肿瘤突变负荷/新抗原水平的ICB耐药机制，特别是I型干扰素（Interferon-γ, IFN-γ）/JAK-STAT通路调控异常除基因突变外尚有其他调控层面未被阐明。长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）已被证实参与抗肿瘤免疫调节，但其在CRC免疫逃逸中具体作用及机制不明。研究人员通过生物信息学筛选鉴定出在CRC中高表达且与CD8⁺T细胞评分负相关、与不良预后相关的新型lncRNA LISS（lncRNA of IFN-γ-signaling suppressor），并从功能、分子机制、体内成瘤及干预治疗多角度证实LISS通过结合CamKIIγ（Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II γ）抑制STAT1 Ser₇₂₇磷酸化进而下调MHC-I（Major Histocompatibility Complex class I）介导的抗原提呈，介导不依赖于MSI状态的免疫逃逸；靶向LISS的反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotide, ASO）可恢复MHC-I表达并增敏ICB。该研究发现为克服CRC（尤其MSS型）ICB耐药提供了新靶点。

主要关键技术方法：

研究人员采用TCGA（The Cancer Genome Atlas）CRC转录组数据集进行全基因组lncRNA筛选（负相关性分析CD8评分及癌/正常表达比＞5倍），结合49例人CRC及配对癌旁组织qRT-PCR与Western blot验证；构建鼠源MSI（MC38）及MSS（CT26）CRC细胞LISS过表达（LISS-OE）与干扰（Knock Down, KD）稳转株及人源MSI（HCT116）与MSS（SW620）LISS-OE/KD稳转株；通过OT-I T细胞共培养、同系移植瘤模型（C57BL/6及BALB/c小鼠，含抗CD8α抗体阻断及OT-I转基因小鼠模型）、Apc^min/+;Villin-CreER^T2;LISS^flox/flox肠上皮特异性LISS敲入小鼠模型评估体内成瘤与免疫微环境；采用RNA Pull-down联合质谱鉴定互作蛋白、RNA CLIP（Cross-linking and Immunoprecipitation）、PLA（Proximity Ligation Assay）、截断体与定点突变明确LISS双茎环结构（723–860 nt，Stem A/B）与CamKIIγ激酶调节域273–290 aa结合并竞争性抑制CamKIIγ-STAT1互作；GAS（IFN-γ Activation Site）荧光素酶报告系统检测IFN-γ/JAK-STAT1通路活性；ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）验证TEAD1结合LISS启动子；脂质纳米粒（Lipid Nanoparticle, LNP）包载LISS-ASO进行体内干预并联合抗PD-1（anti-PD-1）治疗评估疗效。

研究结果

RNA expression profiling screens identify LISS as a potential immune regulatory lncRNA in colorectal cancer

研究人员分析TCGA CRC转录组数据，筛选与CD8评分负相关（r＜－0.2）且在癌组织中上调＞5倍的lncRNA，获得11个交集基因，其中仅linc00626（命名为LISS）具显著预后意义。LISS定位于人1号染色体（灵长类保守），全长1081 nt，无蛋白编码能力，在CRC细胞胞质与胞核均有分布且癌细胞高表达，49例人CRC组织验证其表达高于癌旁并随分期进展升高，提示其为CRC相关免疫调节lncRNA。

LISS expression in colorectal cancer cells attenuates T cell-mediated killing effects

研究人员在MC38（MSI）及CT26（MSS）细胞过表达LISS，接种免疫健全小鼠后肿瘤生长加速，抗CD8α抗体阻断T细胞后此优势消失；LISS-OE瘤内IL-2与IFN-γ分泌降低。OT-I T细胞与OVA负载CRC细胞共培养显示LISS-OE使癌细胞更耐受T细胞杀伤。人HCT116（MSI）及SW620（MSS）细胞LISS-OE增加T细胞杀伤抵抗，LISS-KD则相反。证实LISS过表达削弱CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫且不依赖MSI/MSS状态。

LISS inhibits the activation of JAK/STAT1 signaling and pro-tumor growth by repressing phosphorylation of STAT1 at S727

LISS-KD后RNA-seq显示差异表达基因富集于抗原加工提呈、CD8⁺T细胞激活及IFN-γ信号通路。GAS报告实验示LISS过表达抑制、LISS-KD增强IFN-γ诱导的STAT1转录活性。LISS不影响IFN-γ诱导的JAK磷酸化及STAT1 Tyr₇₀₁磷酸化（pY-STAT1），但显著抑制STAT1 Ser₇₂₇磷酸化（pS₇₂₇-STAT1）及核内pS-STAT1，进而下调MHC-I相关基因（HLA-ABC、TAP1等）及ISGs（IFIT1、IRF1等）mRNA水平，不影响PD-L1/PD-L2表达。STAT1-S727D回补可部分抵消LISS促瘤效应，表明LISS通过抑制pS₇₂₇-STAT1限制IFN-γ/JAK/STAT1轴而不影响免疫检查点配体基因。

LISS restrains STAT1-regulated MHC-I expression to evade T cell immunity

LISS-OE降低小鼠H-2K^b及SIINFEKL-H-2K^b复合物表达及人CRC细胞表面MHC-I，LISS-KD则上调，且依赖STAT1。B2m（β2-microglobulin）KD消除LISS-OE对T细胞杀伤的进一步抑制及体内促瘤作用。证实LISS主要通过抑制STAT1依赖的MHC-I分子表达与抗原提呈能力实现免疫逃逸。

LISS physiologically binds to CamKIIγ via a double stem-loop structure, thereby inhibiting the IFN-γ/JAK/STAT1 signaling axis by suppressing pS-STAT1

RNA Pull-down-质谱鉴定CamKIIγ为LISS互作蛋白，PLA与CLIP证实二者生理互作且IFN-γ增强结合。LISS通过其片段F3-4（723–860 nt）含两个独立茎环结构（Stem A：747–754 nt；Stem B：736–766 nt）结合CamKIIγ调节域273–290 aa（底物结合基序区），双茎环突变（MT-stem A+B）完全废除结合及LISS对CamKIIγ-STAT1互作、pS-STAT1、GAS活性与体内促瘤的抑制。CamKIIγ KD或抑制剂（KN93、W7）消除IFN-γ诱导pS-STAT1且取消LISS对其抑制，野生型而非激酶死型CamKIIγ回补可恢复。表明LISS通过与CamKIIγ双茎环结合占位，阻止CamKIIγ结合并磷酸化STAT1 S727。

LISS forms a negative feedback loop in response to the activation of IFN-γ/JAK/STAT1 signaling

IFN-γ时间/剂量依赖性上调LISS转录（晚于STAT1活化），LISS启动子荧光素酶报告证实转录激活。生物信息学结合KD筛选确定TEAD1（TEA domain transcription factor 1）介导IFN-γ诱导的LISS转录，ChIP证实IFN-γ处理后TEAD1结合LISS启动子TEAD1结合基序，该基序突变使启动子丧失IFN-γ响应。LISS构成IFN-γ/JAK/STAT1信号通路的负反馈环路，被TEAD1转录激活。

LISS promotes intestinal tumor development

49例人CRC组织显示pS-STAT1与MHC-I低于癌旁且与LISS表达负相关，随分期进展降低。肠上皮特异性LISS敲入Apc^min/+小鼠小肠腺瘤数目增多、大腺瘤比例增高、Ki-67⁺增殖细胞增加、CD8⁺T细胞浸润减少、腺瘤pS-STAT1与MHC-I降低、生存期缩短，证实LISS促进肠道肿瘤发生发展并与人CRC中pS-STAT1/MHC-I抑制相关。

Blockade of LISS signaling improves ICB sensitivity

LNP包载LISS-ASO有效敲降LISS，单药部分抑制LISS高表达MC38/CT26移植瘤生长，联合抗PD-1显著缩小肿瘤、提高瘤内IFN-γ⁺CD8⁺T细胞比例、恢复MHC-I表达并延长生存期，对照ASO或LISS低表达肿瘤无此效应。表明靶向LISS的ASO可通过恢复MHC-I抗原提呈增强MSI及MSS型CRC对ICB的响应。

讨论与结论

研究人员在讨论中指出，LISS是相对高丰量的lncRNA，可被IFN-γ滞后诱导形成负反馈，选择性抑制STAT1（而非STAT3/STAT5）pS₇₂₇且不影响PD-L1表达，特异地阻断抑癌分支IFN-γ信号；其双茎环—CamKIIγ（273–290 aa）互作模式具结构可成药性探索价值；LISS为人源特异（灵长类保守，啮齿类无同源基因），其作用主要通过特征性RNA二级结构实现。结论如下：研究人员鉴定出新型免疫调节lncRNA LISS，其在CRC中高表达并通过LISS–CamKIIγ互作抑制CamKIIγ介导的STAT1 S₇₂₇磷酸化，下调STAT1依赖的MHC-I抗原提呈，介导不依赖于MSI状态的T细胞免疫逃逸；IFN-γ经TEAD1转录上调LISS形成负反馈；肠上皮LISS敲入促进Apc^min/+小鼠腺瘤发生；LNP-LISS-ASO恢复MHC-I表达并增敏MSS/MSI CRC对ICB的响应。靶向LISS代表一种有望逆转不同MSI状态CRC对ICB耐药的治疗新策略。