鹿科动物朊病毒（cervid prion）向非人灵长类的有限传播为慢性消耗病（chronic wasting disease, CWD）的人畜共患潜力提供启示

《SCIENCE ADVANCES》：Limited transmission of cervid prions to nonhuman primates provides insights into the zoonotic potential of chronic wasting disease

　　

慢性消耗病（chronic wasting disease, CWD）是一种正在蔓延的鹿科动物朊病毒（prion）疾病。CWD朊病毒在环境中持续存在，经排泄物排出，并在感染鹿科动物的组织中蓄积，引发对其人畜共患（zoonotic）潜力的担忧。研究人员利用食蟹猴（cynomolgus macaque, Macaca fascicularis）探究CWD的人畜共患潜力。尽管多数接种的猕猴未出现临床症状，但灵敏的体外朊病毒扩增检测法（in vitro prion amplification assay）揭示猕猴组织中存有低水平朊病毒。将猕猴组织接种至转基因小鼠（transgenic mouse）和堤岸田鼠（bank vole）可诱导朊病毒病，连续传代后获得100%的传播率。对此发现的一种解读是：CWD朊病毒在不同物种间保有感染性，灵长类感染可能呈非典型表现，但仍具备传播能力。本研究结果对早前认为CWD人畜共患风险极低的结论提出挑战，并强调需持续开展监测。

论文解读：鹿科动物朊病毒（Cervid Prion）向非人灵长类的有限传播为慢性消耗病人畜共患潜力提供启示

该研究发表于《SCIENCE ADVANCES》。慢性消耗病（Chronic Wasting Disease, CWD）是由朊病毒（PrP^Sc，即正常细胞朊蛋白PrP^C错误折叠形成的致病异构体）引起的致死性神经退行性疾病，主要感染白尾鹿、骡鹿、麋鹿及驼鹿等鹿科动物（cervid）。CWD朊病毒因在环境中高度稳定、经唾液及粪便排泄、并在外周与神经组织大量蓄积，理论上存在通过食用受污染鹿肉（venison）或其他途径跨种属感染人类的风险。既往流行病学调查未在CWD流行区发现克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease, CJD）发病率升高，且多数转基因小鼠及松鼠猴实验提示CWD跨越物种屏障（species barrier）感染人的效率极低；但部分体外蛋白错误折叠循环扩增（Protein Misfolding Cyclic Amplification, PMCA）及实时震荡诱导转化（Real-Time Quaking-Induced Conversion, RT-QuIC）实验表明特定CWD毒株经适应后可转化人PrP^C。鉴于食蟹猴（cynomolgus macaque, Macaca fascicularis）在朊病毒人畜共患风险评估中较啮齿类更具预测价值（曾证实牛海绵状脑病BSE可跨种感染并模拟变异型CJD），研究人员开展此项实验以明确CWD接种后食蟹猴是否发生感染、潜伏或亚临床复制，并评估其公共卫生意义。

主要关键技术方法：

研究人员选用18只雌性毛里求斯来源食蟹猴（PRNP基因129位点为Met/Met纯合子），分别经口（oral）或脑内（intracerebral，含不锈钢丝植入法）接种来源于美国及加拿大CWD阳性麋鹿、骡鹿及白尾鹿的脑组织或肌肉匀浆，设CWD阴性对照；动物按计划于接种后4～10年分批安乐死。采集中枢神经系统（CNS，包括不同脑区及颈/胸/腰髓）及脾脏组织，首先采用常规蛋白酶K（Proteinase K, PK）消化后免疫印迹（Western blot）及免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）检测PrP^Sc；因结果为阴性，进一步采用超灵敏PMCA（以表达人PrP^C_129M转基因小鼠脑匀浆为底物，三轮扩增后PK消化Western blot判定）及RT-QuIC（以小鼠或堤岸田鼠重组PrP为底物，硫黄素T荧光监测，部分样本经磷钨酸镍钠NaPTA富集）检测朊病毒播种活性（seeding activity）。随后将CWD接种猴组织匀浆接种至过表达麋鹿PrP^C的转基因小鼠（TgElk mice）及109位Met/Met纯合的堤岸田鼠（bank vole, Myodes glareolus），观察发病情况并行二代、三代传代；再将堤岸田鼠发病脑组织回传至过表达白尾鹿PrP^C的转基因小鼠（TgDeer mice），通过Kaplan-Meier生存曲线、Western blot糖基化比例、石蜡包埋组织印迹（Paraffin-Embedded Tissue Blot, PET-blot）及IHC综合判定。

研究结果：

Transmission and pathogenic assessment of CWD in cynomolgus macaques（食蟹猴中CWD的传播与致病性评估）：

18只雌性食蟹猴接受CWD阳性鹿科动物组织接种（口服或脑内），3只对照接种CWD阴性材料。多数动物观察期内（最长7.5年初步分析）无典型朊病毒病症状，但2只（口服AU501及脑内钢针植入AU389）出现共济失调（ataxia）、震颤、焦虑及消瘦等神经症状。常规Western blot（PK消化后）及脑/脊髓IHC均未检出PrP^Sc。提示CWD接种后食蟹猴可长期维持无症状或仅有轻微非特异性体征，且经典病理检测灵敏度不足以发现早期/低水平感染。

Ultrasensitive detection of CWD-macaque prions（CWD-猴源朊病毒的超灵敏检测）：

采用PMCA（三轮，人PrP^C_129M底物）检测6/7只CWD接种猴脑组织、4/6只脾脏呈阳性（出现PK抗性PrP^res信号），阴性对照全阴；最强信号见于口服接种猴AU467脑组织的不同皮层区域呈异质性分布。RT-QuIC（辅以NaPTA富集及底物替换延长至75～80 h）在部分猴的延髓、颈髓及脾脏检出明显播种活性，与PMCA结果吻合。结论：尽管常规方法阴性，高灵敏PMCA与RT-QuIC证实CWD接种的食蟹猴CNS及外周淋巴组织中存在低水平具播种能力的致病PrP构象，支持体内复制而非单纯残留接种物，因脑外部位（脊髓、脾）亦有阳性且接种界面远端亦检出。

Transmission of CWD-macaque prions to transgenic mice expressing cervid PrP（CWD-猴源朊病毒向表达鹿科PrP的转基因小鼠的传播）：

将CWD接种猴（AU501、AU467、AU519、AU389）的CNS及脾匀浆接种TgElk小鼠，攻击率（attack rate）最高20%（1/5～2/7依组织而异），潜伏期94～344天，出现共济失调、脊柱后凸等体征，但发病及未发病小鼠脑/脊髓经Western blot均未能检出PK抗性PrP^Sc，RT-QuIC仅检出低水平播种活性；二代传代TgElk小鼠潜伏期缩短至106天仍无PrP^Sc免疫印迹阳性。结论：猴源CWD朊病毒对TgElk具低水平感染性但初次传代不形成典型PK抗性PrP^Sc，提示猴体内复制产生的PrP^Sc构象不稳定或为蛋白酶敏感型（protease-sensitive PrP^Sc），需经易感宿主适应后才显现经典生化特征。

Transmission of CWD-infected macaque prions to bank voles（CWD感染猴源朊病毒向堤岸田鼠的传播）：

将TgElk一代或二代发病鼠组织接种堤岸田鼠，首代攻毒部分鼠发病（存活期双峰分布225～686 dpi），二代脑/脊髓/小肠匀浆攻毒获100%攻击率且潜伏期显著缩短（平均约464 dpi）。首代及二代发病田鼠脑与脊髓Western blot检出典型三带型PK抗性PrP^Sc，RT-QuIC证实脑、脊髓及小肠（首代小肠仅RT-QuIC阳性、Western blot阴性）具播种活性；PET-blot显示广泛PrP^Sc沉积（Ⅱ型模式）。小肠具播种活性且仅见于经猴传代的CWD而非直接野外CWD分离株。结论：经TgElk初步适应后，CWD-猴源朊病毒在堤岸田鼠中完全适应并产生典型PrP^Sc与全表型朊病毒病，证实猴组织携带的感染性朊病毒可跨种传递并在易感宿主体内恢复完整致病力，且具有独特的组织嗜性（胃肠道播种活性）。

Transmission of bvCWDmac back to cervidized mice（bvCWDmac回传至鹿源化小鼠）：

将发病堤岸田鼠（bvCWDmac）脑组织接种TgDeer(1536^+/+)小鼠获100%感染率（平均476.8 dpi），脑与脊髓检出PK抗性PrP^Sc，糖基化比例与堤岸田鼠不同，PET-blot呈突触型（Ⅰ型）沉积区别于田鼠的Ⅱ型。结论：经猴→TgElk→堤岸田鼠传代的CWD朊病毒可再次感染鹿PrP过表达小鼠，证明CWD-猴源朊病毒保有完整跨种感染性及毒株适应性改变能力。

讨论（Discussion）部分总结翻译如下：

非人灵长类（尤其是食蟹猴）是研究朊病毒人畜共患风险的合适模型。本研究报道食蟹猴经口或脑内接种CWD阳性鹿科组织后，中枢及外周组织中存在朊病毒播种活性，多数动物处临床前阶段仅2只出现轻微神经症状。超灵敏PMCA与RT-QuIC检出低水平PrP^Sc播种活性，且在接种部位远隔组织（如脑内接种后脾、脊髓阳性）提示体内扩增而非单纯残留接种物。CWD-猴源组织可传代感染TgElk小鼠及堤岸田鼠，后者经适应产生100%攻击率及典型PrP^Sc，再回传鹿PrP小鼠验证感染性。首次TgElk传代未检出PK抗性PrP^Sc可能与蛋白酶敏感型PrP^Sc或瞬时不稳中间体有关，类比可变蛋白酶敏感性朊病毒病（Variably Protease-Sensitive Prionopathy, VPSPr）。本研究与早前认为食蟹猴对CWD高度抵抗的结论不同，提示CWD可在灵长类中发生低效、非典型、亚临床感染并保留生物学感染性，传统诊断方法可能低估风险。研究局限包括观察期未达全部动物自然终点、所用CWD分离株未经毒株鉴定、无法完全排除残存接种物但远隔组织阳性支持体内播散。总之，结果不意味着CWD高效感染灵长类，但表明在特定条件下可发生具感染力的跨种留存且常规手段无法检出，随CWD流行范围扩大人暴露风险上升，需持续警惕与监测。