我国食管鳞状细胞癌高发地区的血清非靶向代谢组学谱分析

《International Journal of General Medicine》：Serum Untargeted Metabolomics Profiling of Esophageal Squamous Cell Carcinoma in High-Incidence Areas of China

　　

摘要

背景：食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是起源于上消化道的常见恶性肿瘤，在中国具有极高患病负担。代谢重编程是肿瘤的重要标志，血清代谢物已被证实参与多种胃肠道肿瘤的发生发展；然而，其在ESCC中的作用仍有待进一步阐明。

目的：本研究旨在表征ESCC患者与健康对照（healthy controls，HCs）之间血清代谢的差异，并探索其在ESCC起始中的潜在作用。

方法：于2023年9月至2024年9月，研究人员招募70例既往未接受治疗的ESCC患者和72例匹配的HCs。采用超高效液相色谱-Orbitrap-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-Orbitrap-tandem mass spectrometry，UHPLC-Orbitrap-MS/MS）进行血清非靶向代谢组学分析，随后开展生物信息学分析。

结果：与HCs相比，ESCC患者中共鉴定出713种差异表达代谢物，其中脂质和类脂分子占比最高（16.1%）。代谢通路富集分析显示，不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFAs）生物合成是失调最显著的通路（P<0.001），共涉及7种关键代谢物：顺-11-二十碳烯酸、顺-11,14-二十碳二烯酸、二十二碳五烯酸、芥酸、亚油酸、油酸和棕榈酸。与HCs相比，这7种代谢物在早期（I–II期）和局部进展期（III期）ESCC患者中均显著升高，而两类患者之间无显著差异。基于这些代谢物构建的诊断特征模型曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.804（95%置信区间：0.729–0.880）。

结论：本研究表明，ESCC患者存在显著的血清代谢改变，尤其表现为脂质代谢和UFA生物合成异常。由7种代谢物构成的组合面板对ESCC具有较好的区分性能，提示其具有作为生物标志物的潜力。

本文发表于《International Journal of General Medicine》，聚焦中国食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）高发地区人群的血清代谢异常特征。研究背景在于，ESCC在中国尤其是华北高发地区具有显著的地域聚集性，尽管近年来多学科治疗策略不断改进，但患者总体预后仍不理想，5年总生存率依然较低。传统危险因素如吸烟、饮酒和饮食习惯虽已较为明确，但尚不足以完整解释高发地区ESCC的病因异质性与发生机制。因此，亟需从分子层面识别可反映疾病早期发生的生物学特征。代谢重编程作为恶性肿瘤的重要标志之一，能够直接反映宿主遗传背景、环境暴露及肿瘤生物学行为的综合效应。相较于其他组学，代谢组学更贴近表型，尤其适用于生物标志物发掘与早期筛查研究。既往ESCC代谢组学研究已报道若干具有潜在临床转化价值的代谢物模型，但不同研究之间受检测平台、样本类型、地域环境及生活方式差异影响，结果存在明显异质性。因此，在中国ESCC高发地区进一步开展高灵敏度平台支持下的血清非靶向代谢组学研究，具有重要的病因学探索和筛查转化意义。

为此，研究人员纳入来自河北省这一ESCC高发地区的病例与对照人群，系统描绘ESCC患者血清代谢谱，并寻找与疾病发生密切相关的关键代谢物及异常代谢通路。研究结果表明，ESCC患者血清代谢谱与健康对照存在显著分离，提示其具有独特的代谢表型。差异代谢物中，脂质和类脂分子占比最高；进一步分析发现，不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFAs）生物合成是最显著失调的代谢通路，其中7种关键脂肪酸代谢物在ESCC患者中一致升高。基于这7种代谢物构建的组合模型表现出较好的区分能力，提示其作为无创血清生物标志物的应用前景。总体而言，该研究从系统代谢层面揭示了ESCC高危人群的重要代谢特征，支持脂质代谢重编程，特别是UFA生物合成异常，在ESCC发生中具有关键作用。

本研究的主要技术方法包括：采用病例-对照研究设计，样本来源于2023年9月至2024年9月河北医科大学第四医院，最终纳入70例I–III期、未经治疗的ESCC患者和72例匹配健康对照；使用超高效液相色谱-Orbitrap-串联质谱（UHPLC-Orbitrap-MS/MS）进行血清非靶向代谢组学检测；经XCMS流程完成峰提取、比对与积分，并用BiotreeDB进行代谢物注释；采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）、KEGG通路富集分析、Kruskal–Wallis H检验及logistic回归和受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析评估诊断性能。

在“Clinical Information”部分，研究显示所有受试者均为中国河北省汉族常住居民，ESCC组与健康对照组在基线人口学和生活方式特征方面差异无统计学意义（均P>0.05），保证了后续比较的可比性。这为代谢差异主要反映疾病状态而非基线混杂因素提供了基础支持。

在“Raw Data Analysis of Metabolomics”部分，研究人员通过非靶向代谢组学共注释出3587种血清代谢物。按HMDB超类（super class）分类，脂质和类脂分子占比最高，为19.15%，其次为有机杂环化合物、苯类化合物以及有机酸及其衍生物。这一整体分布提示，血清代谢组成中脂质相关分子占据重要地位，也为后续发现脂质代谢异常奠定了基础。

在“Screening of Differential Metabolites Based on OPLS-DA”部分，研究人员利用OPLS-DA发现HCs与ESCC患者的代谢谱明显分离，多数样本点位于95%置信区间内，说明两组存在显著不同的代谢表型。模型经200次置换检验验证，R²Y=0.933，Q²=0.715，且回归截距显示不存在明显过拟合，提示模型稳定可靠。按照VIP>1且P<0.05的双重标准，共筛得713种显著差异代谢物，其中上调418种、下调295种。定量分析进一步指出，(1β,2α,3α)-1,2,3,24-Tetrahydroxy-12-oleanen-28-oic acid上调最显著，而Sapidolide_A下调最显著，表明ESCC相关代谢紊乱范围广泛且方向不一。

在“Hierarchical Cluster Analysis of Differential Metabolites”部分，研究对差异代谢物中最丰富的四大类进行了层次聚类分析，分别为脂质和类脂分子、苯类化合物、有机杂环化合物以及有机酸和衍生物。热图显示HC组与ESCC组在这些主要代谢物类别上的表达模式存在清晰分层，进一步证明ESCC伴随系统性代谢重塑，其中脂质相关改变最为突出。

在“Differential Metabolic Pathways and Metabolites”部分，研究人员将差异代谢物映射至KEGG数据库后发现，其在多条代谢与疾病相关通路中呈现不同分布模式。其中，脂质代谢中的“不饱和脂肪酸生物合成”亚类所占差异特征比例最高，达到18.42%。进一步通路富集分析共识别出8条具有统计学意义的异常通路，其中“不饱和脂肪酸生物合成”最显著（P<0.001）。该通路涉及7种差异代谢物，且均为显著上调。研究还通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）镜像谱与标准品比对，对这7种关键脂肪酸的身份进行了验证，提高了代谢物鉴定的可信度。该结果明确指出，ESCC的代谢异常主要集中于脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸合成网络。

在“Association of Seven Key Metabolites in Biosynthesis of UFAs with ESCC Clinical Stages and HCs”部分，研究进一步比较了这7种关键代谢物在健康对照、早期ESCC（I–II期）以及局部进展期ESCC（III期）中的水平。结果显示，顺-11-二十碳烯酸、顺-11,14-二十碳二烯酸、二十二碳五烯酸、芥酸、亚油酸、油酸和棕榈酸在早期组和局部进展组中相较健康对照均显著升高（均P<0.05），而早期组与局部进展组之间均无显著差异（均P>0.05）。这提示UFA生物合成异常并非晚期肿瘤的继发现象，而是在ESCC发生早期即已出现并持续存在，因而具有早期识别价值。

在“Construction of a Diagnostic Model Distinguishing ESCC Patients from HCs”部分，研究通过ROC曲线评估7种关键代谢物的诊断潜能。单个代谢物的AUC分别为：顺-11-二十碳烯酸0.76、顺-11,14-二十碳二烯酸0.77、二十二碳五烯酸0.71、芥酸0.74、亚油酸0.76、油酸0.78、棕榈酸0.72，均表现出中等区分能力。在此基础上，研究进一步建立包含全部7种代谢物的联合诊断模型，AUC达到0.804，95%置信区间为0.729–0.880，显示出更优的区分效率。这表明多代谢物联合可提升ESCC的无创识别能力。

讨论部分围绕脂质代谢重编程在ESCC中的意义展开。研究指出，ESCC患者血清中脂质和类脂分子是最主要的异常代谢物类别，而UFA生物合成则是最显著的异常通路，这与肿瘤代谢重编程的一般规律一致。UFA有助于维持细胞膜流动性、支持快速增殖并调控氧化还原平衡；棕榈酸虽为饱和脂肪酸，但其作为从头脂肪酸合成的重要中间体，可为后续延长和去饱和反应提供底物，因此同样处于这一重编程网络核心位置。研究还指出，亚油酸、油酸和棕榈酸等在既往ESCC血清或血浆代谢组学研究中亦曾被报道升高，说明本研究发现具有一定一致性。此外，不同样本类型的既往研究也提示脂肪酸及相关脂质代谢异常与ESCC进展有关。作者同时强调，该研究仍存在单中心、样本量相对有限、差异筛选未进行多重检验校正、OPLS-DA模型需外部验证、血清代谢难以完全代表组织特异性代谢状态以及横断面研究无法证明因果关系等局限，因此结果仍需在更大规模、多中心及机制性研究中进一步证实。

结论：本研究在中国北方ESCC高发地区河北开展，采用UHPLC-Orbitrap-MS/MS血清非靶向代谢组学分析发现，ESCC患者与健康对照相比存在显著代谢改变，其中脂质和类脂分子为失调最明显的代谢物类别。不饱和脂肪酸生物合成是富集程度最高的异常通路（P<0.001），涉及7种关键代谢物且均显著上调。与健康对照相比，这7种代谢物在早期（I–II期）和局部进展期（III期）ESCC患者中均升高，而两类患者之间无显著差异。由这7种代谢物构建的诊断模型AUC为0.804（95%置信区间：0.729–0.880），显示出良好的区分性能。这些发现为理解高危人群ESCC的代谢特征提供了新的认识，并为ESCC早期筛查提供了有前景的无创诊断生物标志物面板。