2022年至2023年间，从博茨瓦纳发现的8种萨宾2型（Sabin 2）衍生脊髓灰质炎病毒和5种新型口服脊髓灰质炎疫苗2型衍生循环疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（CVDPV）的完整基因组序列，这些病毒均具有单端重组特征

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequences of eight poliovirus Sabin 2-derived and five novel oral poliovirus 2-derived circulating vaccine-derived poliovirus (CVDPV) genomes with single-end recombination from Botswana, 2022–2023

　　

摘要

我们报告了从博茨瓦纳环境废水监测样本中检测到的13种循环疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（cVDPV）的完整基因组序列。其中8种cVDPV来源于Sabin 2，5种来源于nOPV2，这些病毒在基因组的P3区域存在单端重组现象。

公告

脊髓灰质炎病毒属于Picornaviridae科和Enterovirus coxsackiepol属，是一种单链正链RNA（+ssRNA）病毒，其基因组长度约为7,500个核苷酸，是导致脊髓灰质炎的病原体。为应对2型循环疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（cVDPV2）带来的全球性威胁，研究人员通过基因工程开发了一种新型口服2型脊髓灰质炎疫苗（nOPV2），并于2021年3月首次在全球范围内推广（1，2）。nOPV2是在先前使用的2型单价OPV（mOPV2）基础上进行改良的版本，旨在提供类似的脊髓灰质炎防护效果，并同时增强遗传稳定性，从而降低病毒恢复为具有致瘫能力的神经毒力形式并引发疫情的风险（2）。在博茨瓦纳收集了13份环境废水样本（见表1），并将其送往南非国家传染病研究所（NICD）进行病毒分离、型内差异检测和Sanger测序，随后通过FTA卡片将这些样本送往美国疾病控制与预防中心（CDC）进行下一代测序（NGS），以完成脊髓灰质炎病毒成分的nOPV2基因特征分析。病毒RNA使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（目录号52906；Qiagen）提取，cDNA则使用SuperScript IV First-Strand Sequencing System（目录号18091200；Invitrogen）和随机六聚体引物生成。cDNA第二链合成采用Klenow Fragment（3′?5′ exo-）（目录号M0212S，NEB）进行。测序文库使用Nextera XT Library Preparation Kit（目录号FC-131-1096；Illumina）制备，并在Illumina MiSeq平台上进行测序，采用配对末端2 × 250 bp的读取长度。

表1

表1 2022–2023年从博茨瓦纳采集的13种单端重组疫苗衍生基因组的测序总结

平均覆盖率
与VP1参考序列（AY184220）的SNP数量对比
预处理后的总读取次数
后处理后的总读取次数
映射后的总读取次数
GC含量PX725678SRR36585189< />< />PX725679SRR36585188< />< />PX725680SRR36585184< />< />PX725681SRR36585183< />< />PX725682SRR36585182< />< />PX725683SRR36585181< />< />PX725671SRR36585180< />< />PX725672SRR36585179< />< />PX725673SRR36585178< />< />PX725674SRR36585177< />< />PX725675SRR36585187< />< />PX725676SRR36585186< />< />PX725677SRR36585185< />< />

GenBank访问号	SRA访问号	样本名称	采集年份	类型	国家	地区/城市	监测类型	基因组长度（nt）
2023	博茨瓦纳	东南区/哈博罗内	环境样本	7,500	1,241.3	7	502,782	402,660	50,192	46.4%
2023	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,501	1,081.5	8	908,924	617,534	63,520	46.3%
2023	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,501	85.2	8	39,812	28,680	4,787	46.4%
2023	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,501	119.2	9	132,792	90,441	7,740	46.3%
2023	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,501	800.1	9	579,592	446,477	43,880	46.4%
2023	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,439	1,868.7	19	975,928	741,370	87,103	46.4%
2022	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,439	46.6	21	32,264	24,760	3,041	46.5%
2022	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,439	1,963.8	17	842,854	715,264	86,399	46.6%
2022	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,439	469.2	19	208,974	170,537	24,751	46.5%
2022	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,439	556.8	19	1,117,618	872,846	30,294	46.6%
2022	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,439	2,312.9	17	1,018,612	847,873	102,371	46.6%
2022	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,439	82.0	17	109,516	34,146	5,333	46.5%
2022	博茨瓦纳	东北区/弗朗西斯敦	环境样本	7,439	2,293.6	17	1,142,520	858,630	112,748	46.6%

原始FASTQ读取数据使用VPipe v1.0进行处理，这是一种用于病毒识别的内部NGS读取处理工具（3），采用默认参数。此外，还在Geneious Prime v2024.0.7中使用GenBank编号AY184220作为参考序列进行了基于参考的基因组组装，同样采用默认参数和中等灵敏度设置，从而获得了完整的脊髓灰质炎病毒基因组。使用MAFFT v7.490生成多重序列比对，将组装的基因组与Sabin 2参考基因组（AY184220）进行比对，以验证共识序列、识别单核苷酸多态性（SNPs）以及任何重组事件（见表1），并通过转换识别来确定重组事件。在Geneious Prime中使用Mr. Bayes v3.2.6插件和HKY替代模型及伽马率变异构建了衣壳树（见图1）。

图1

图1 博茨瓦纳的单端重组cVDPV环境样本。衣壳树显示两个不同分支，一个来源于Sabin 2，另一个来源于nOPV2。所有属于Sabin 2分支的基因组都属于RDC-MAN-5分支，这8个样本在该分支内的基因组模式非常相似（99.1%–99.95%的成对一致性）。所有属于nOPV2分支的基因组都属于BOT-FRA-1分支，这5个样本在该分支内的基因组模式也非常相似（99.7%–99.93%的成对一致性），并且保留了5′UTR区域的Cre和P2区域的knockout Cre（KO Cre）。通过Geneious软件，通过转换百分比一致性识别了重组事件。这有助于确认是否确实发生了重组，如果确实发生了重组，将其与其他全球脊髓灰质炎病毒基因组数据库中的重组基因组进行比较可以验证分析结果。“None”（浅灰色）表示未观察到重组的基因组区域。紫色表示P3区域的重组模式，其最接近的匹配序列是用于双价疫苗的AY184221 Sabin 3基因组。蓝色表示P3区域的重组模式，其最接近的匹配序列是远缘的肠病毒C。所有13个博茨瓦纳基因组在P3区域都只发生了一次重组事件；然而，这两个分支的基因组模式有所不同。

所有13个博茨瓦纳完整基因组序列均被鉴定为cVDPV（4），因为与AY184220相比，VP1区域的SNP数量≥6个。所有基因组的P3区域都检测到了重组事件（见图1），并且确定了它们与两个不同的分支的关联（5）。8个Sabin 2衍生的cVDPV基因组与RDC-MAN-5分支相关联，这些基因组在P3区域存在重组事件，这是Sabin 2衍生VDPV的常见特征（5）。5个nOPV2衍生的cVDPV基因组与BOT-FRA-1分支相关联。这5个基因组代表了一种新的VDPV-nOPV2（VDPV-n）分支，其特点是5′UTR区域没有发生重组，而之前的分支则发生了涉及5′UTR和整个P2/P3区域的双重重组（6）。BOT-FRA-1分支的独特之处在于5′UTR区域的Cre和P2区域的KO Cre保持不变，但仍发生了基因组重组。

致谢

本报告中的发现和结论仅代表作者的观点，并不一定代表美国疾病控制与预防中心的官方立场。

我们想感谢全球脊髓灰质炎实验室网络的所有实验室成员，特别是南非约翰内斯堡国家传染病研究所的脊髓灰质炎实验室同事，以及博茨瓦纳的当地公共卫生监测工作人员。