高温蒸汽预处理（High-Temperature Steam Pretreatment, HTSP）菜籽粕在酱油发酵中的应用：滋味、香气及微生物群落（Microbial Communities）的动态演变

《Food Chemistry: X》：Application of high-temperature steam pretreatment of rapeseed meal in soy sauce fermentation: dynamic evolution of taste, aroma, and microbial communities

　　

摘要：菜籽粕（Rapeseed Meal）富含蛋白质，但其高值化利用仍不充分。本研究应用高温蒸汽预处理（High-Temperature Steam Pretreatment, HTSP）处理菜籽粕，以降低安全与风味限制因子并改善其作为酱油发酵原料的适用性。与对照组（CON组）相比，HTSP显著降低了菜籽粕中硫代葡萄糖苷（Glucosinolates）、异硫氰酸酯（Isothiocyanates）、芥酸（Erucic Acid）及酚类相关化合物的含量，其中硫代葡萄糖苷和异硫氰酸酯分别降低59.02%和92.65%。同时，蛋白质、可溶性蛋白及还原糖含量分别增至39.28、16.42和1.18 g/100 g，分别为对照组的1.11、2.01和1.97倍。随后研究人员以HTSP处理菜籽粕为主要原料进行酱油发酵。在1–15 d发酵期内，发酵15 d的样品表现出最适宜的理化与风味特征。此阶段总氮、氨基酸态氮（Amino Acid Nitrogen）、还原糖、总酸和可溶性固形物含量分别达1.16、0.70、2.13、1.22和34.31 g/100 mL，分别为第1天的4.30、3.33、3.23、30.50和4.73倍。发酵过程中滋味轮廓由苦涩、酸味向甜鲜味转变，香气轮廓由果香向坚果香、烘焙香及花香演变。相关性分析表明，魏斯氏菌属（Weissella）和鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是与菜籽粕酱油品质及风味发育密切相关的重要微生物类群，可能分别参与早期呈味物质积累和中后期香气物质的形成。综上，HTSP有效提升了菜籽粕作为发酵底物的利用潜力，支持其在酱油酿造中的高值化应用。

论文解读——高温蒸汽预处理菜籽粕在酱油发酵中的应用及滋味、香气与微生物群落动态研究（发表于《Food Chemistry: X》）

研究背景与立题依据

菜籽（Rapeseed）是我国重要的油料作物，制油副产物菜籽粕（Rapeseed Meal, RM）年产量巨大且富含蛋白质（34.4%–47.3%），但因含硫代葡萄糖苷（Glucosinolates）、异硫氰酸酯（Isothiocyanates）、芥酸（Erucic Acid）、芥子碱（Sinapine）、单宁及粗纤维等抗营养因子与不良风味物质，目前多用于饲料，在食品领域的高值化利用受限。传统酱油以大豆为核心蛋白源，面临原料压力，亟需开发替代植物蛋白原料。菜籽粕蛋白以11S球蛋白（Cruciferin）和2S白蛋白（Napin）为主，结构较紧密、β-折叠含量高，酶解效率低，需高效预处理改善底物可利用性。物理预处理中蒸汽爆破（Steam Explosion）可破坏纤维-蛋白复合体但可能造成风味损失，而高温蒸汽预处理（High-Temperature Steam Pretreatment, HTSP）通过蒸汽传热调节物料结构且不经历骤爆释压，有望兼顾底物改性与风味保留。目前HTSP改善菜籽粕结构特性及提升其酱油酿制适用性的研究尚少见。因此，研究人员采用HTSP处理菜籽粕，评估其对抗营养因子消减、理化性质改变及微观结构的影响，并以处理后为原料接种米曲霉（Aspergillus oryzae strain JY309）与鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）制曲并进行高盐稀态（Moromi）发酵，系统解析发酵过程中理化指标、非挥发性代谢物（Non-VOCs）、挥发性有机物（Volatile Organic Compounds, VOCs）及微生物群落（Microbial Communities）的动态演变，探讨关键微生物与品质风味的关联，为菜籽粕在发酵调味品中的高值化利用提供理论依据。

主要关键技术方法

研究人员以市售脱脂菜籽粕为原料，经HTSP（120 °C，0.103 MPa，30 min）处理后测定抗营养因子（硫代葡萄糖苷用HPLC-DAD、异硫氰酸酯用HPLC-DAD、芥酸用GC-FID、芥子碱用HPLC、单宁和总酚用试剂盒）及理化指标（蛋白质按ISO 5983-1、可溶性蛋白用Bradford法、还原糖用DNS法、色度用色差仪）、扫描电镜（SEM）观察微观形貌。HTSP处理菜籽粕与小麦粉混合蒸煮后接种米曲霉JY309与鲁氏接合酵母（比例1:1，接种量0.1%）32 °C制曲48 h并测定中性/酸性/碱性蛋白酶及糖化酶（Glucoamylase）活力；成曲加18%盐水（w/v NaCl）42 °C发酵15 d，于第1、5、10、15天取样。发酵液测总氮（Total Nitrogen）、氨基酸态氮（Amino Acid Nitrogen, AAN）、还原糖、总酸、可溶性固形物（Soluble Solids）；非挥发性代谢物用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）非靶向代谢组学分析；VOCs用顶空-气相色谱-离子迁移谱（Headspace Gas Chromatography-Ion Mobility Spectrometry, HS-GC-IMS）检测并计算相对气味活性值（Relative Odor Activity Value, ROAV）；微生物群落用宏基因组（Metagenomics）DNA提取、Illumina NovaSeq测序及Majorbio云平台进行α/β多样性、LEfSe及与理化风味指标的相关性（Mantel Test）分析。实验设三次生物学重复，数据以均值±标准差表示，p<0.05为差异显著。

研究结果

3.1. Analysis of antinutritional factors and safety-related compounds in rapeseed meal under HTSP conditions

HTSP使硫代葡萄糖苷从284.47 mg/kg降至116.57 mg/kg（降59.02%，低于欧盟新型食品参考限值约120 mg/kg），异硫氰酸酯从12.12 mg/kg降至0.89 mg/kg（降92.65%），芥酸从3.22 mg/g降至2.25 mg/g（降30.31%），芥子碱从10.13 mg/g降至1.95 mg/g（降80.71%），单宁从13.43 mg/g降至10.41 mg/g（降22.53%），总酚从7.46 mg/g降至5.50 mg/g（降26.22%）。结论：HTSP有效削减菜籽粕主要安全与风味限制因子。

3.2. The analysis of the physicochemical properties of rapeseed meal under HTSP conditions

HTSP使蛋白质从35.51增至39.28 g/100 g，可溶性蛋白从8.16增至16.42 g/100 g（2.01倍），还原糖从0.60增至1.18 g/100 g（1.97倍），水分从6.53增至10.21 g/100 g，灰分略降；色度L和b下降、a*上升，表明Maillard反应发生。结论：HTSP提高可利用氮源、碳源及水分，促进微生物利用并为后续发酵提供前体。

3.3. The changes in the appearance and morphology of rapeseed meal after HTSP treatment

SEM显示HTSP组表面粗糙度增加并形成皱褶结构。结论：HTSP改变微观形貌，增大比表面积利于微生物附着定植及吸水。

3.4. Changes in enzymatic activities during koji preparation

米曲霉分泌酶类中碱性蛋白酶24 h达峰（496.93 U/g），酸性与中性蛋白酶48 h达峰（分别434.12、511.48 U/g），糖化酶36 h达峰（283.55 U/g）且48 h仍较高。结论：选定48 h为最佳制曲时间以保证持续酶活与风味前体积累。

3.5. Analysis of physicochemical properties of SY

发酵至第15天（SY-15）总氮1.16 g/100 mL（第1天4.30倍）、氨基酸态氮0.70 g/100 mL（达中国一级酱油国标，第1天3.33倍）、还原糖2.13 g/100 mL、总酸1.22 g/100 mL、可溶性固形物34.31 g/100 mL，均显著高于前期（p<0.05）。结论：15 d发酵底物降解与氮/糖/酸释放充分，SY-15综合理化品质最优。

3.6. Analysis of non-VOCs in SY

UPLC-MS/MS注释745种非挥发性代谢物，筛选66种差异代谢物（氨基酸及衍生物26种等）。发酵中苦味相关氨基酸衍生物（Lysopine、Leucylleucine）占比下降，糖类及其衍生物、芳香化合物（如4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮）、Maillard相关杂环化合物占比上升。结论：发酵推进蛋白降解、碳水转化及Maillard反应，滋味由苦/酸向甜/鲜协调演变，SY-15非挥发性轮廓利于呈味。

3.7. HS-GC-IMS analysis

鉴定61种VOCs信号（酯15、醛11、酮11、醇12等）。早期（1–5 d）以醇、酯为主呈果香/酒香；中期酮、醛增多；后期（15 d）苯乙醛（Phenylacetaldehyde, ROAV=100）、2-呋喃甲醛（2-furaldehyde, ROAV=69.83）、2,5-二甲基吡嗪（2,5-Dimethylpyrazine）、1-辛烯-3-酮（1-Octen-3-one, ROAV=60.56全程关键）等富集，呈坚果/烘焙/花香。结论：香气由果香向坚果-烘焙-花香演变，ROAV确定各阶段关键呈香物。

3.8. Microbial community dynamics during SY fermentation

3.8.1 α/β多样性：Chao1、Shannon、Simpson指数第10天最高，第15天略降；PCoA/NMDS显示早期（1–5 d）群落相似，5 d后明显演替。

3.8.2 群落结构：门水平早期子囊菌门（Ascomycota）>75%，后期变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）占优；属水平早期米曲霉属（Aspergillus）、魏斯氏菌属（Weissella）为主，中期鲁氏接合酵母属（Zygosaccharomyces）升高，后期Corynebacterium等增多；种水平Weissella cibaria第1天约30%，Zygosaccharomyces rouxii第5天丰度高其后降。

3.8.3 LEfSe（LDA>4）：第1天Aspergillus或/Weissella为标志物，第5天Z. rouxii为标志物，第10天Proteobacteria/Chloroflexi相关类群，第15天Verrucomicrobia/Acidobacteria相关类群。

3.8.4 相关性：Weissella与可溶性固形物、总酸强正相关（r=0.9–1, p<0.01），与氨基酸态氮正相关；Z. rouxii与氨基酸态氮、酯类（乙酸异戊酯等）、高级醇（3-甲基-1-丁醇等）显著正相关。苯乙醛、2-呋喃甲醛与多数优势微生物显著相关。结论：Weissella可能主导早期产酸与呈味基础，Z. rouxii主导中后期酯/醇/醛等特征香气形成，二者协同驱动风味演变。

讨论与结论翻译（Conclusion部分浓缩总结）

HTSP处理有效降低菜籽粕硫代葡萄糖苷（降59.02%）、异硫氰酸酯（降92.65%）、芥子碱（降80.71%）等限制因子，提升蛋白、可溶性蛋白（增至16.42 g/100 g）及还原糖（增至1.18 g/100 g），改善微观结构利于微生物附着。以HTSP菜籽粕酿制的酱油（SY）制曲48 h酶活良好，发酵15 d氨基酸态氮达0.70 g/100 mL（符合一级酱油标准），总氮、还原糖、总酸及可溶性固形物同步显著提升；非挥发性代谢物中苦味肽/氨基酸衍生物减少，甜味/鲜味/Maillard相关物积累；VOCs由早期果香醇酯演变为后期坚果/烘焙/花香（关键物含苯乙醛、2-呋喃甲醛、2,5-二甲基吡嗪及全程重要的1-辛烯-3-酮）；宏基因组显示微生物有序演替，Weissella与Z. rouxii分别关联早期呈味物积累与中后期特征香气形成。研究表明HTSP通过削减限制因子并改善底物可利用性，增强菜籽粕作为酱油发酵原料的潜力，为其高值化应用于发酵调味品提供技术与理论支撑。