《ACS Nano Medicine》：From Paramural Structures to Re-Engineered Nanocarriers: Progress and Limitations of Green Nanovesicles in Drug Delivery
编辑推荐：
植物胞外囊泡历经数十年才被确认为真实的生物学实体。这一曾仅属于植物科学家的研究领域，如今因其在跨界通讯中的作用可产生治疗效应，正受到纳米医学研究人员的广泛关注。此外，其普遍存在的生物相容性、在许多体系中表现出的低毒性以及植物来源的优势，使其成为极具吸引力的药物
植物胞外囊泡历经数十年才被确认为真实的生物学实体。这一曾仅属于植物科学家的研究领域，如今因其在跨界通讯中的作用可产生治疗效应，正受到纳米医学研究人员的广泛关注。此外，其普遍存在的生物相容性、在许多体系中表现出的低毒性以及植物来源的优势，使其成为极具吸引力的药物递送候选者。然而，其转化应用受限于囊泡组成和理化性质的高度来源依赖性差异，以及分离、表征和命名法中持续存在的不一致性。本综述追溯了该领域从早期对植物副质体囊泡样结构的观察到当前将植物来源囊泡定位于药物递送和纳米治疗剂的努力。研究人员讨论了已提出的生物发生途径，并总结了生物医学应用的最新进展。重要的是，研究人员还探讨了命名法、分离和制剂控制中尚未解决的问题如何继续使整个领域的解释复杂化，并塑造了向重工程化囊泡系统发展的趋势。本综述的核心焦点在于植物来源囊泡如何被重工程化为更均一、可控的纳米囊泡，旨在改善制剂一致性、可扩展性及载药性能，同时保留有利的脂质介导特性。最后，研究人员批判性地将这些系统与传统的脂质体进行了比较，强调了将植物胞外囊泡定位为满足复杂治疗需求的绿色替代方案时所面临的机遇与局限。总体而言，本综述旨在更新该领域现状，并明确概述必须解决的可重复性、标准化和转化开发等关键瓶颈，以实现临床转化和商业开发。
引言
游离药物固有的溶解度差、稳定性低、毒性高及难以跨越生物屏障等问题，催生了对疾病适配型递送系统的迫切需求。特异性地将药物递送至病灶部位一直是医学追求的终极目标。在蓬勃发展的纳米技术与生物技术推动下，过去几十年涌现出多种纳米颗粒递送技术。早期的纳米颗粒设计虽未能高效递送药物，但经过多年的设计改良，已逐步克服游离药物的诸多局限并成功跨越生物屏障。例如，首个上市脂质体药物阿霉素脂质体（Doxil）于1995年获得批准。尽管脂质体是最早且研究最深入的递送候选者之一，其作为通用载体的广泛应用仍面临诸多挑战。近年来全球范围内的成功案例包括利用脂质纳米颗粒（LNP）递送编码COVID-19抗原的mRNA，但该成功主要局限于SARS-CoV-2免疫接种，未必能直接推广至其他疾病。值得注意的是，任何递送系统的大规模生产均为资源密集型且成本高昂，COVID-19疫苗递送亦不例外，许多发展中国家在疫情期间主要依赖捐赠和人道主义援助。加之药物与递送系统成本飙升及研发管线收窄，开发更经济、环保的递送系统迫在眉睫，此类系统虽未必万能，但应能提供显著优势并成为递送体系中的重要选择。
近年来，生物或仿生递送系统发展迅速。在脂质体发现约20年后，研究人员发现活体生物中天然形成结构相似的脂质囊泡，即目前通称的胞外囊泡（EV）。EV是由细胞形成的膜结构，可将不同活性生物分子从产生细胞转运至接收细胞，进而改变接收细胞的生理状态。自发现以来，EV始终是持续扩展的热点领域。凭借作为生理和病理状态有效生物载体的双重特性，EV提供了两种独特的应用路径：一是利用其先天生物学能力模拟自然愈合过程的疗法；二是将其作为载体将治疗物质运送至修复部位的递药系统。其纳米级尺寸及天然包封能力使其成为纳米治疗的潜在候选者。目前研究多集中于哺乳动物EV，相比之下，植物EV的研究历程曲折，甚至植物释放EV的能力也曾受质疑，因其具有细胞壁等显著差异结构。经过40余年的证据积累，过去十年间植物来源EV的关注度持续增长，不仅局限于其在植物界内的作用，更延伸至其在哺乳动物界的转化潜力。这种关注源于其跨界物种的先天治疗潜力和货物转运能力。
目前，研究人员正探索植物EV是否可作为哺乳动物EV的补充替代方案，以规避后者的技术缺陷。现有研究表明，植物EV正日益成为与哺乳动物EV乃至合成纳米颗粒（如脂质体）并列的研究对象。例如，与哺乳动物来源EV相比，植物EV可能具备大规模生产潜力，且人畜共患病病原体传播风险更低。然而，这些潜在优势需结合命名法、分离、囊泡起源、货物异质性、处理伪影及来源依赖性变异等未解决问题综合考量。因此，植物EV代表了一个前景广阔但仍处于演进中的平台，在对抗疾病及开发纳米药物递送系统方面展现出潜力，尤其适合利用其独特的生理生化特性运输多种剂量。此外，确立其治疗和递药地位的研究仍处于萌芽阶段。一个核心争议在于命名法，由于植物EV命名尚未统一，文献中存在植物外泌体、植物外泌体样纳米囊泡、植物来源囊泡、植物外泌体样纳米颗粒、植物来源可食用纳米颗粒及植物来源纳米脂质等多种术语，科学界尚未达成共识。为简化表述，本综述采用“绿色纳米囊泡”作为统称，指代该领域整体或植物来源的囊泡系统；同时使用“原始植物EV”特指文献中讨论的天然非重工程化囊泡；“重工程化绿色纳米囊泡”指经脂质提取与重组构建的工程化载体系统。鉴于该领域命名仍在演进，且并非所有已发表研究均能明确证实囊泡的细胞外或质外体起源，这些术语仅作为清晰表述的框架，而非绝对的生物学分类。遵循国际细胞外囊泡学会（ISEV）现行指南，本综述不将“外泌体”作为EV的通用同义词，仅在具备特定生物发生相关证据时使用，否则均采用更广泛的术语。
本综述总结了绿色纳米囊泡历经数十年的发展历程及其重要地位，重点聚焦于其在治疗领域尤其是药物递送方面的转化影响。虽然也会回顾目前已研究的其固有治疗应用，但核心在于探讨如何将原始EV重工程化为更稳健的结构，以增强其载药能力并实现高效的靶向递送。研究人员同时阐明了为何需要对其进行重工程化，而非直接利用原始形态进行递药。值得注意的是，既往多数综述未能区分原始EV与重工程化纳米囊泡。此外，为凸显绿色纳米囊泡在药物递送领域的广泛适用性，讨论不局限于单一疾病类型。同时，本综述还将其与常用纳米颗粒（如脂质体）进行异同比较，并详细阐述载药效率与稳定性等方面内容。
发展历程
植物释放EV的现象曾争议数十年。然而，证明其存在的证据可追溯至1967年，比哺乳动物EV于1983年被发现早近15年，也比其于1987年正式命名更早。20世纪60年代末，研究人员在胡萝卜细胞内质膜与细胞壁之间的区域发现了多个圆形簇状结构，震惊学界。多项研究通过透射电子显微镜（TEM）证实了胡萝卜细胞中多泡体（MVB）的存在，及其与质膜融合并将次级囊泡喷射至细胞壁间隙的过程。随后的几十年里，这些次级囊泡被称为EV，但在当时被称为次级囊泡、副质体囊泡、MVB内囊泡或腔内囊泡（ILV）。继这些观察之后，科学家持续在植物细胞间隙液中检测到囊泡，并支持MVB调控次级囊泡释放的作用。后续研究发现这些纳米囊泡参与细胞增殖与分化过程。下一个十年中，MVB和副质体囊泡被观察到可诱导感染大麦条纹花叶病毒的大麦叶片组织细胞壁增厚。后续研究揭示大豆MVB内的囊泡在内吞途径中发挥作用，并将外源性阳离子化铁蛋白递送至植物细胞溶酶体区室或液泡。
尽管当时未明确称为EV，但它们已在植物中发挥生理作用。与此同时，哺乳动物EV直至20世纪80年代初才被发现，并被视作“垃圾”或“细胞尘埃”。按时间线推算，植物EV本应在那些年得到更多研究，但遗憾的是并未如此。90年代除在小麦叶片间隙洗涤液中检测到内切蛋白酶（提示其可能通过副质体囊泡转运）外，该领域并无重大突破。
直至上世纪末，上述零散信息仍未使科学界达成共识，植物EV仍需通过确凿存在来巩固地位。2006年，研究报道大麦叶片中的MVB与质膜融合，由此产生副质体囊泡，并通过TEM研究证实。尽管这些副质体囊泡被认为类似于哺乳动物EV，但仍未获得广泛认可。2008年，在向日葵种子细胞外液中发现了磷脂基囊泡。次年，首次通过真空渗透-离心法从向日葵中分离纯化出EV并分析其形态组成。同年，研究人员培育出表达绿色荧光蛋白（GFP）标记PEN1蛋白的转基因拟南芥，该蛋白在质膜外的质外体空间仍持续发光，表明其受到保护。这促使多位研究者推测该现象可能通过EV分泌实现。此后，研究人员在拟南芥、烟草、长春花和槲寄生等多种植物中发现纳米囊泡。同时，这些纳米囊泡与植物疾病及生理功能的联系也被逐步揭示，特别是其在细胞壁重塑和防御蛋白（用于抵抗植物真菌感染）中的作用。数十年的实验共同支持了植物EV的发现。
直到2011年国际细胞外囊泡学会（ISEV）成立后，科学家才开始从治疗角度关注绿色纳米囊泡，并探索其在纳米医学中的转化潜力。
生物发生与组成
在确认绿色纳米囊泡存在后，研究人员首要关注的是阐明其生物发生机制。早期证据表明植物在应对多种生物和非生物胁迫时释放纳米囊泡，但后续发现即使在无胁迫刺激的正常生理条件下植物也会释放。基于当前进展，存在三种潜在的生物发生途径：MVB途径、外泌体阳性细胞器（EXPO）途径和液泡途径。最早且被广泛接受的理解是MVB与细胞质膜融合，将次级囊泡释放至细胞外空间。与哺乳动物EV生物发生类似，ESCRT复合物（ESCRT-0、-I、-II、-III）参与植物纳米囊泡的产生，更重要的是参与其货物分选。高等植物虽不具有典型的ESCRT-0复合物，但含有保守VHS结构域的TOM1样（TOL）蛋白可替代ESCRT-0作为泛素结合蛋白，在液泡货物分选中发挥作用。随后，泛素结合蛋白将货物运至ESCRT-I和ESCRT-II复合物，进而激活ESCRT-III复合物。最终，ESCRT-III复合物收缩质膜并切割胞质面出芽的颈部，将携带货物的ILV喷射至细胞外空间。
与传统MVB途径不同，据报道拟南芥和烟草细胞遵循一种更独特、非经典的分泌途径，即EXPO途径。EXPO是一种球形双层膜结构，形态类似自噬体，不与溶酶体区室或内体融合，而是与质膜融合并将单膜囊泡喷射至细胞壁。该途径涉及Exo70和Sec6等外泌体复合物成分，在囊泡运输和融合步骤中起关键作用。最后，在病原体攻击下，植物液泡也被报道可向细胞外空间释放载有货物的纳米囊泡以抵御病原体。此外，上述途径的相互作用共同导致植物分泌纳米囊泡。
过去十年对于揭示这些纳米囊泡的跨界通讯至关重要，它们可调节细胞信号传导和功能。最初普遍认为这些纳米囊泡必然装载了某些功能性货物，负责调节接收细胞的功能。研究发现，在纳米囊泡的货物分选/生物发生过程中，蛋白质、核酸和其他代谢物等生物活性分子被包裹在类似于其原生细胞膜结构和组成的脂质双层中。然而，该领域的功能主张仍需进一步验证。未来应通过小RNA测序、先进蛋白质组学、代谢组学和脂质组学更系统地分析内源性货物，从而将生物学效应与货物关联，而非仅凭宽泛的囊泡身份推断。所装载的生物活性分子种类受植物来源显著影响。尽管尚未充分探索，但同一植物若产自不同地区（地理变异）也可能影响绿色纳米囊泡的内容物。此外，环境条件也可能参与调控其组成。鉴于此，在选择特定纳米囊泡进行研究前应进行深思熟虑，因为其组成及后续的跨界转化作用可能深受收获条件的影响。
分离与纯化
绿色纳米囊泡的分离包含两个关键步骤：样品制备，随后是分离纯化。在进入纯化步骤前，需通过混合、研磨、挤压等物理过程破坏植物组织以提取不同部位的汁液。由于前文详述了生物发生，必须理解命名争议的一个根源在于：许多研究通过榨汁过程提取绿色纳米囊泡，而非直接从植物细胞分离细胞外液——后者才是EV的目标来源。此外，随着绿色纳米囊泡研究的深入，相对侵入性较低的榨汁方法可能会逐步发展，进而有望缓解纯度问题，甚至可能解决命名争议。本综述仅简要概述常用的分离纯化策略。
值得注意的是，目前尚无专门针对绿色纳米囊泡纯化的方法，所有分离纯化技术主要借鉴自哺乳动物EV，如超速离心、尺寸排阻色谱、超滤和共沉淀。这些技术利用尺寸、密度、电荷、溶解度和表面暴露蛋白等物理特性，将囊泡与其他生物污染物分离。尽管尚未建立公认的植物特异性方案，但该领域若能转向采用数量有限且依据更充分的流程，而非持续依赖高度可变的研究特定程序，将大有裨益。对于旨在代表细胞外或质外体囊泡的制剂，基于澄清、过滤和密度梯度纯化的保守流程（优选辅以垫层密度梯度超速离心及可选的下游尺寸排阻色谱）可能在回收率和纯度之间取得更好平衡。对于源自汁液或组织破坏的制剂，前端可能仍需差速离心，但理想情况下应随后进行密度梯度和/或尺寸排阻色谱，而非仅依靠差速离心。至少，研究应报告颗粒产率、总蛋白回收率、颗粒与蛋白比率（作为粗略纯度指标）、尺寸分布和形态，同时提供完整的方案细节，并在实验中设置非囊泡或EV耗竭组分等阴性对照。
本文后续章节将集中阐述绿色纳米囊泡在纳米医学领域的发展，重点强调其在药物递送中的应用，这也是本综述的核心。
原始植物EV作为治疗剂的最新进展
本节使用“原始植物EV”一词区分天然非重工程化系统与重工程化囊泡，但需注意各引用研究中证实其细胞外或质外体起源的程度并不一致。原始植物EV在生物医学应用领域提供双重益处：首先是其固有的治疗特性；其次是作为高效药物递送系统。过去十年，原始植物EV在治疗多种疾病方面展现出巨大潜力。由于本综述主要关注药物递送方面，后续章节将仅总结原始EV固有治疗应用的最新重要研究，并在后面章节详细讨论药物递送应用。关于2020年前发现的所有治疗功能（包括免疫调节、抗癌、肝保护作用、肠上皮再生及整体健康促进），详细讨论可参见Dad及其同事的综述。
此前，原始EV的抗炎作用是其主要治疗发现之一，在溃疡性结肠炎的肠稳态维持、肠上皮再生乃至抗癌效应中发挥幕后作用。显然，受过去几年COVID-19疫情的严重影响，研究人员的兴趣转向感染性疾病，特别是SARS-CoV-2感染。在此背景下，路易斯维尔大学的Huang-Ge Zhang团队（也是绿色EV治疗发现及向纳米医学转化的先驱）揭示，生姜来源的绿色EV成功改善了SARS-CoV-2感染小鼠的肺部炎症。细胞因子风暴是严重SARS-CoV-2感染的标志，生姜EV幸运地能够抑制涉及核因子κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6和IL-1β的炎症级联反应。该研究至关重要，因为它首先证明了感染综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的肺上皮细胞释放的外泌体（Nsp12和Nsp13）在感染健康细胞并引发细胞因子风暴中的作用，其次证明生姜绿色EV能够通过减轻过度炎症来抑制感染。研究发现生姜EV中的microRNA（aly miR396a-5p）是关键因素，其可结合SARS-CoV-2病毒基因的多个结合位点，从而阻断病毒基因表达。同样，该团队还研究了生姜EV根除 notorious 牙周病原体牙龈卟啉单胞菌感染的作用。该研究有助于理解绿色EV如何影响致病机制，具体而言，其内源性载荷（脂质和miRNA）抑制了牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶活性和血凝素表达。最重要的是，研究发现磷脂酸（PA）通过调节牙龈卟啉单胞菌表面的血红素结合蛋白35（HBP35）介导了绿色EV的摄取。尽管这一有益的新发现令人鼓舞，但该研究缺乏关于绿色EV对多微生物生物膜抑制作用的报告，而这在更现实的体内环境中更可能出现。相反，它仅强调了其对单菌种生物膜的影响，这需要未来更深入的研究。在另一项近期研究中，大蒜EV也被报道可延缓胰岛素抵抗和脑部炎症，并在小鼠模型中有效对抗肥胖。
此前，生姜、葡萄柚、柠檬和西兰花来源的EV是研究治疗作用的主要对象。近两年，另一种来源也日益受到研究人员关注，即人参。目前，人参EV已显示出多方面的治疗谱，涵盖抗衰老、抗癌和神经再生作用。据报道，人参EV可逆转皮肤成纤维细胞和黑素细胞中与年龄相关的表型。此外，研究发现二酰甘油（DG）作为一种生物活性脂质，可能负责通过PKC和PKD信号通路介导细胞间的交换并精确触发皮肤细胞的反应。除此之外，人参EV的抗癌活性也得到了研究。研究人员探索了其在免疫检查点抑制剂（ICI）疗法（失活抑制性免疫受体）中重编程“冷”肿瘤微环境的作用。通过整合人参EV和程序性细胞死亡蛋白-1单克隆抗体（PD-1 mAB）的方法，机制研究表明人参EV重编程了肿瘤相关巨噬细胞，进而促进CCL5和CXCL9的释放，使CD8+T细胞浸润至肿瘤微环境。简而言之，人参EV通过诱导T细胞浸润至“冷”肿瘤（非炎性）并将其转变为“热”肿瘤（炎性），增强了PD-1 mAB的抗癌效应，这是实现成功ICI疗法的关键步骤。除上述研究外，人参EV研究的亮点在于其神经再生潜力。人参EV通过转移其固有的治疗性miRNA载荷，解决了骨髓干细胞（BMSC）神经分化不足的问题。研究发现人参EV的摄取依赖于其与BMSC的孵育时间，并将大量miRNA转运至BMSC内。RNA测序分析显示tr-miR159a、har-miR403a和ccamiR396a-3p是主要的miRNA进入者。进一步的基因集富集分析指出PI3K信号通路不仅是触发处理后的BMSC分化、发育并获得神经功能的关键机制，也是触发神经细胞生成的关键。此外，人参EV通过促进Ca2+离子瞬时内流和K+内流，刺激BMSC的电生理功能性，从而促进了感觉活性的激发。EV随时间依赖性被BMSC摄取的特性，要求利用能够确保EV稳定释放的递送基质。为此，研究人员利用明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶，因其具有适应神经损伤部位极不规则形状的卓越灵活性，并在体内研究中将人参EV稳定释放至神经损伤部位。这项研究一方面提示了人参EV的神经再生潜力，另一方面也证实了原始EV（一般而言）可被纳入其他递送系统而不损害其功能性的灵活性。同样，苦参来源的EV天然富含芦丁（天然药理活性化合物），可通过抑制氧化应激微环境逆转脊髓损伤。附带一提，该研究也为在体内环境中利用水凝胶实现治疗性EV的稳定释放提供了支持。此外，在一项最新研究中，研究人员首次利用猕猴桃EV递送siRNA-STAT3，通过靶向表皮生长因子受体（EGFR）突变的癌细胞，逆转了多药耐药性肺癌。另一项关于柠檬EV的有趣研究揭示了其在抑制肾小管细胞内质网应激从而延缓肾钙化生长中的积极作用。此外，该研究强调了柠檬EV从小肠到肾脏的自然运输途径。由于其非免疫原性，它们在血液循环中保持结构完整，并经由肾脏自然排泄途径，在排出过程中阻止草酸钙结晶。
尽管除了常食用的食物外，引入替代医学中流行的草药和植物以拓宽治疗潜力值得欢迎，但不应忘记某些草药可能对人类具有潜在毒性，因此该领域需要研究人员格外谨慎。
重工程化纳米囊泡
为何需要重工程化？
多项研究建议利用原始EV进行药物递送。然而，大多数研究依赖其自然靶向潜力，且主要针对胃肠道疾病。尽管原始EV可提供其固有成分与所载药物分子的协同效应，但药物分子与EV固有成分之间发生相互作用的风险无法完全避免。此外，目前关于原始EV组成的研究十分匮乏。植物来源的变异进一步加剧了这一问题。这也带来了载药能力低下的挑战，因为囊泡内部已被固有内容物占据。为了向原始EV装载药物分子，其结构完整性可能在装载过程中产生的短暂扰动中受损。在载货过程中，它们可能丢失部分结构组成成分，从而导致丧失固有治疗潜力。因此，利用原始EV进行药物递送可能适得其反。例如，一项研究报告称，人参EV在超声处理后刺激巨噬细胞的能力显著降低，这表明完整结构的重要性。最重要的是，原始EV普遍存在尺寸异质性问题。即使在同一物种内，尺寸变异范围也可达约50至500 nm。这一困境对其作为药物递送载体的应用构成了巨大挑战，因为递送系统的尺寸异质性会极大影响药物的药代动力学特征、体内清除率，并可能导致药物在组织内的滞留存在差异。除此之外，原始EV易形成聚集体，这可能阻碍其静脉给药的应用。除了载药能力和尺寸异质性的局限外，重工程化的另一个重要动因是需要将生物学功能与天然囊泡货物的内在变异性解耦。原始EV携带复杂且难以控制的RNA、蛋白质和代谢物混合物，这些成分随植物物种、生长条件和生理状态而变化，使得可重复性和机制解释变得复杂。从确定的脂质库中重构囊泡，能够在最小化由内源性腔内容物引起的非预期或可变信号的同时，更好地控制具有生物活性的脂质成分。重工程化还旨在揭示特定脂质类别的功能贡献，这些脂质正日益被认为是囊泡生物活性的主要驱动因素，而非被动的结构元件。最新研究表明，选择性操控原始EV来源的脂质组成可改变免疫调节、代谢和治疗结果，这支持了脂质中心重构能够实现仅靠完整囊泡无法达到的功能调谐的观点。另一个新兴的理由是重工程化植物脂质纳米囊泡能够通过蛋白冠形成和脂质-蛋白相互作用与生物系统相互作用，从而以可预测的方式调节免疫和炎症通路。源自植物EV的脂质纳米颗粒已被证明能够以不同于合成脂质体和天然囊泡的方式塑造其体内的蛋白冠及下游细胞反应，突显了重工程化作为一种获取新生物学机制的策略。最后，重工程化促进了标准化和转化可扩展性，因为脂质提取和重组减少了对完整囊泡完整性和异质性货物的依赖，从而实现更一致的制剂、表征和质量控制。综上所述，这些考虑表明在某些环境下，重工程化绿色纳米囊泡可能提供比原始EV更可控的平台，尽管其功能和机制优势仍需更广泛的验证。
如何实现重工程化？
随着绿色纳米囊泡研究的扩展，研究人员对其组成成分的了解也在增加。在这方面，关于其脂质生物学作用的报告也日益增多。例如，近年来研究人员了解到其脂质双层膜在生理和
