《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：In silico design and testing of a multi-epitope camel mastitis vaccine candidate for development
编辑推荐：
引言：骆驼乳腺炎由包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）在内的多种致病细菌引起，对非洲干旱和半干旱地区的社会经济造成了巨大损失。尽管金黄色葡萄球菌和无乳链球菌是环境污染物
引言：骆驼乳腺炎由包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）在内的多种致病细菌引起，对非洲干旱和半干旱地区的社会经济造成了巨大损失。尽管金黄色葡萄球菌和无乳链球菌是环境污染物，但后者是一种具有人畜共患潜力的感染源。在气候变化和抗生素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）加剧的背景下，开发安全有效的骆驼乳腺炎疫苗已成为一个紧迫的优先事项。方法：研究人员对从肯尼亚牧民骆驼群奶样中分离的本地金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）和鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）菌株进行了基因组测序和组装。利用VaxiJen分析了减去的蛋白质组以筛选抗原性蛋白，并使用AllerTOP、PSORTb和DeepTMHMM分别评估了候选蛋白的致敏性、亚细胞定位和跨膜螺旋数量。随后，利用Bepi-Pred-2.0、NetCTL 1.2和NetMHCII 2.3从抗原性蛋白序列中鉴定了B细胞和T细胞表位，用于设计一种潜在的疫苗候选物，该候选物需要展现出足够的免疫原性、稳定性和灵活性，且不具有毒性和致敏性。结果：研究人员设计并计算评估了一个源自20个抗原性金黄色葡萄球菌和无乳链球菌蛋白的多表位骆驼乳腺炎疫苗候选物。该候选物表现出理想的免疫原性，无致敏性和毒性，并值得进一步的实验验证。讨论：综上所述，研究人员设计并计算评估了一个潜在可行的骆驼乳腺炎疫苗候选物。
本研究深入探讨了利用计算生物学方法设计针对骆驼乳腺炎的新型疫苗的前沿策略。骆驼乳腺炎是由金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）等多种病原菌引起的乳腺内感染，对非洲干旱和半干旱地区（ASALs）牧民的生计和营养安全构成严重威胁。这些地区严重依赖骆驼（Camelus dromedarius）提供奶、肉和收入。当前，该病的治疗面临严峻挑战，主要源于抗生素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）的日益加剧、生物膜的形成，以及骆驼独特的乳房解剖结构使得乳腺内抗生素治疗效果不佳。此外，气候变化导致的牧场短缺迫使牧民骆驼迁徙，可能加速耐药基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）的传播。因此，开发一种安全、有效的骆驼乳腺炎疫苗，特别是针对主要病原菌的亚单位疫苗，成为保障骆驼健康和牧民生计的紧迫需求。
为了应对这一挑战，研究人员开展了本项基于免疫信息学（Immunoinformatics）和计算模拟（In silico）的研究。他们从肯尼亚牧民骆驼群中患病骆驼的奶样中分离出金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）和鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）本地菌株。研究人员的主要目标是：1) 获取这些菌株的蛋白质组数据；2) 通过计算分析筛选出具有免疫原性的蛋白质；3) 从中预测出能引发有效免疫反应的B细胞和T细胞表位；4) 基于这些表位构建一个多表位疫苗候选物；5) 全面评估该候选物的物理化学特性、三维结构稳定性、与免疫受体的相互作用以及预测的宿主免疫反应。
研究团队首先对五种细菌的蛋白质组进行了去冗余处理，并利用VaxiJen v2.0工具以0.7的阈值筛选抗原性蛋白。初步筛选出的蛋白随后通过PSORTb和SignalP 5.0进行亚细胞定位和信号肽分析，通过DeepTMHMM分析跨膜结构，通过AllerTOP评估致敏性，并通过SPAAN预测黏附特性。最终，研究人员聚焦于金黄色葡萄球菌和无乳链球菌这两种主要的致病菌，从中选出了19种位于细胞膜或分泌型的抗原性蛋白。接着，使用Bepi-Pred 2.0、NetCTL 1.2和NetMHCII 2.3等工具，在这些蛋白序列中预测了线性B细胞表位、细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL）表位和辅助性T淋巴细胞（Helper T Lymphocyte, HTL）表位。预测的CTL表位基于其MHC-I类分子的结合亲和力进行筛选，HTL表位则基于其与MHC-II类分子（评估了HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*01:03, HLA-DRB1*03:01等位基因）的强结合能力以及诱导干扰素-γ（IFN-γ）的潜力进行筛选。
基于筛选结果，研究人员将9个高亲和力CTL表位和1个能诱导IFN-γ产生的HTL表位串联起来，构建了疫苗骨架。CTL表位之间使用AAY连接肽连接，HTL表位使用GPGPG连接肽连接。为了增强免疫原性，在疫苗序列的N端通过EAAAK连接肽融合了人白细胞介素-12（Interleukin-12, IL-12）的α链作为佐剂，并在C端添加了用于纯化的6×His标签。最终构建的疫苗候选物全长为353个氨基酸。
对设计好的疫苗候选物进行了一系列计算评估。VaxiJen预测其抗原性得分为0.5596（高于0.4的阈值）。AlgPred 2.0和AllerCatPro评估显示其不与已知过敏原具有序列或结构相似性，表明其可能无致敏性。利用ProtParam工具分析的理化性质显示，该蛋白分子量约为39.7 kDa，理论等电点（pI）为6.15，不稳定性指数（II）为37.30（小于40，表明稳定），在体外预测半衰期长，脂肪族指数和平均亲水性（GRAVY）值表明其具有良好的热稳定性和水溶性。通过AlphaFold 3服务器预测的三维模型显示，该蛋白主要由α-螺旋和连接环组成，模型模板建模评分（pTM）为0.52（大于0.5），表明整体折叠预测可靠。拉马奇兰图（Ramachandran plot）分析显示，93.94%的残基位于有利区域，表明模型结构合理。分子对接模拟（使用ClusPro服务器）显示，该疫苗候选物能够通过其C端区域与Toll样受体-2（Toll-like Receptor 2, TLR-2，PDB ID: 5D3I）相互作用，结合能为-31.36 kJ/mol。界面相互作用分析揭示了氢键和水介导的接触。正常模式分析（使用iMODS服务器）表明疫苗候选物与TLR-2形成的复合物具有足够的柔韧性。最后，通过C-ImmSim服务器进行的免疫模拟预测，该疫苗候选物能够诱导产生高水平的免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM），同时抗原水平下降，并能激活辅助性T细胞、细胞毒性T细胞以及多种细胞因子和白细胞介素的合成，预示着强大的宿主免疫反应。
该研究的意义在于，它利用成本效益高、周期短的计算模拟方法，成功设计并验证了一个具有潜力的多表位骆驼乳腺炎疫苗候选物。这为后续在实验模型（如小鼠模型）中验证其免疫原性和保护效力奠定了重要基础，并为应对骆驼乳腺炎和AMR威胁提供了新的思路。论文发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》期刊。
尽管研究取得了重要进展，作者也指出了其局限性。首先，目前的评估完全基于计算模拟，缺乏分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟数据来详细解析疫苗与TLR-2复合物的动态相互作用，也亟需湿实验验证。其次，疫苗候选物在大肠杆菌等表达系统中的实际表达水平、可溶性以及免疫原性需要在体外和体内实验中确认。再者，需要检测免疫小鼠血清中的IgG滴度，并进行细菌攻毒实验以评估其实际保护效果。此外，田间分离株之间可能存在的抗原变异性，以及在牧民流动性大的环境下疫苗分发的实际挑战，也是未来需要考虑的问题。
总体而言，本研究通过免疫信息学方法，从针对骆驼乳腺炎主要病原菌的抗原蛋白中筛选并整合了关键表位，设计了一个新型多表位疫苗候选物。其计算评估结果（免疫原性、稳定性、安全性及与TLR-2的相互作用）均显示出良好的应用前景，为开发针对这一重要动物疾病的高效疫苗提供了重要的理论设计和前期依据，是应对AMR和保障牧民生计的有益探索。
