《Discover Agriculture》：Accelerating climate resilient agriculture through the integration of molecular breeding with genome editing and omics approaches
气候变化对全球粮食安全构成了深刻威胁，尤其是在脆弱的干旱和半干旱生态系统中。传统育种在应对如耐旱和耐热等复杂的多基因性状（polygenic traits）方面仍显不足，这使得分子育种（molecular breeding）变得至关重要。本综述综合了分子育种四十年来的演进历程，追溯了从基础的限制性片段长度多态性（RFLP）标记到高分辨率的多样性基因分型测序（DArTSeq）平台、基于CRISPR的基因组编辑（genome editing），以及新兴的多组学（multi-omics）整合过程。研究人员对202篇同行评审文章（1986–2025）进行了系统分析，以评估分子标记及其在分子标记辅助选择（MAS）、数量性状位点（QTL）定位、全基因组关联研究（GWAS）、基因组编辑和组学技术中的应用如何增强牧草物种和主要作物的抗逆性。本综述的范围限于英文文献，重点关注牧草与谷物类作物而非豆科和树种。综述结论指出，尽管高成本和技术复杂性在资源有限的环境中仍是主要障碍，但多组学与高通量表型分析（high-throughput phenotyping）的整合提供了一个有前景的框架。这些进步弥补了基因型到表型之间的鸿沟，能够精确叠加抗逆与营养基因，从而加速可持续、气候智慧型农业（climate-smart agriculture）的发展。
### 引言
气候变化对全球农业可持续性和粮食安全构成深刻威胁，尤其是在干旱和半干旱地区，雨养农业极易受到生物和非生物胁迫的影响，目前干旱区约占地球陆地表面的41%。开发具有气候抗逆性的作物品种已成为全球优先事项，但传统植物育种仍受限于其对表型选择的依赖，在解决耐旱性和养分利用效率等复杂多基因性状方面存在局限性，这使得分子工具在加速遗传改良中变得不可或缺。分子标记已从早期的限制性片段长度多态性（RFLP）等系统演变为更近期的标记，以及高分辨率的多样性基因分型测序（DArTSeq）平台，这反映了从低通量、可重复性较差的方法向高分辨率、可扩展平台的转变。这些进展促进了现代育种技术的应用，包括分子标记辅助选择（MAS）、数量性状位点（QTL）定位和全基因组关联研究（GWAS），这些技术正日益与CRISPR-Cas系统和组学方法相辅相成，以实现对调控抗逆性状的DNA序列进行精确、定向的修饰。在脆弱的干旱生态系统中，牧草和谷类作物，包括狗牙根属（Cynodon）物种、象草、罗兹草、珍珠粟、高粱以及其他豆科作物，对于维持牲畜系统和人类营养至关重要。尽管这些物种具有固有的抗逆特性，但它们需要遗传增强以满足日益增长的食物和饲料需求。分子育种方法是解开这些作物物种复杂性状的理想选择；然而，其广泛应用受到诸多挑战的阻碍，如高昂的初始成本、技术复杂性、基因型与环境互作（G x E）以及标记在不同遗传背景间有限的可转移性。
尽管现有的综述已经涉及主要作物并单独聚焦于分子标记，本综述全面综合了四十年（1986–2025）的分子演进，弥合了分子标记历史演进与新兴分子育种技术（MAS、GWAS、QTL定位、CRISPR-Cas系统和多组学）之间的鸿沟。这特别针对干旱和半干旱农业生态系统中的气候抗逆性牧草和主粮作物。与以往的叙述性总结不同，本研究采用严格的方法论框架来评估从基础RFLP标记到高通量基因分型和基因组编辑的过渡。此外，它提出了一个整合框架，以克服资源有限环境中的基因型-表型关联（genotype-to-phenotype gap）障碍，为致力于在前所未有的环境变化时代实现气候智慧型农业的研究人员和政策制定者提供可操作的见解。
### 方法与途径
本综述系统地综合了当前关于分子标记在气候抗逆作物育种计划及其他领域中应用的知识。遵循透明且可复现的方法，流程包含五个主要相互关联的阶段：文献检索、筛选与资格评估、数据提取与分类、定量综合以及解释，如流程图所示（图1）。方法论图示说明了分子育种证据系统性综合的方法。
#### 文献检索
在39年（1986–2025）期间，在Google Scholar、PubMed、Scopus和Web of Science上进行了系统检索，捕捉了分子标记从早期一代到现代高通量基因分型和基因组编辑平台的演进。检索参数整合了特定的标记类型关键词（“RFLP”、“RAPD”、“AFLP”、“SSR”、“SNP”、“SilicoDArT”和“DArTSeq”）、育种应用关键词（“MAS”、“QTL mapping”、“GWAS”和“CRISPR”）以及气候适应性状关键词（“产量稳定性”、“营养品质”以及“非生物”和“生物”胁迫），针对关键的干旱区物种如“牧草物种”、“谷物”和“豆科”以及其他作物。为确保全面的证据，数据库结果辅以来自授权存储库（FAO、CGSpace、学位论文、通讯/杂志和报告）的灰色文献。
#### 筛选与资格评估
筛选遵循两阶段过程，受预先设定的纳入因素和排除理由约束。具有特定分子焦点（包括分子标记、MAS、GWAS、QTL和CRISPR）并分析气候抗逆作物物种中生物和/或非生物胁迫的同行评审、英文版本文章被优先纳入。另一方面，基于分子分析细节不足、重复、非目标结果、数据空白、无法获取全文和非主要来源（图1）的研究被排除。
#### 数据提取与分析
数据提取使用标准化的Microsoft Excel模板记录文献和方法细节。变量按出版年份、作物类型（牧草、谷物、豆科和其他作物）和特定性状焦点（产量稳定性、抗逆性和营养品质）进行分类。数据进一步根据标记类型和特定应用（遗传多样性、MAS、GWAS、QTL定位和CRISPR）进行分类。技术世代：常规（形态性状）、第一代（RFLP）、第二代（RAPD、AFLP、SSR）、第三代（SNP、DArTSeq）以及现代应用时代，该时代利用这些工具进行MAS、GWAS、QTL定位、CRISPR编辑和多组学。
使用R软件（版本4.5.2）进行了统计摘要，包括相对比例和频率，为综合和分析工作流程提供了定量基础。本综述的结构框架和系统性流程使用R包‘DiagrammeR’绘制。方法论架构使用‘grViz’函数构建。提取的数据在R环境中使用‘dplyr’和‘tidyr’包进行数据处理，使用‘ggplot2’进行高分辨率可视化。输出使用‘viridis’调色板以确保可访问性，并使用‘ggpubr’包以便于图表排列和确保分析结果的连贯呈现。
### 结果
#### 引用文献的选择与特征
系统检索和筛选过程，如流程图（图2）所示，最终从1456篇初始记录中筛选出202篇高质量文章作为最终分析语料库。在去除重复并筛选1139篇独立标题后，419篇全文文章因其方法学细节和主题与本综述范围的契合度被严格评估。最终选出的202篇研究为分析分子标记从早期RFLP到现代高通量基因分型和CRISPR-Cas平台的四十年演进提供了坚实的实证基础。这个精炼的数据集确保了后续定量综合基于技术相关且历史全面的证据。
#### 时间趋势与技术演进
202篇选定文章的时间分布，涵盖1986年至2025年，揭示了研究活动的清晰上升轨迹（图3A）。这一进程标志着从1980年代基础研究（分子标记的初始时代，发表量有限，每年少于3篇）到2010年后指数级增长的显著转变。在2000年代，一个稳定增长阶段变得明显，这主要得益于第二代分子标记在遗传多样性和群体结构分析中的应用。最显著的增长发生在过去十年，文章数量在2024年达到27篇的峰值，其次是2023年的21篇。这一趋势表明，本综述基于当前更新的知识构建，反映了高通量基因分型、GWAS和CRISPR-Cas整合的快速采用。
如图3B所示，常规发现构成了文献的最大部分（68篇；33.7%），为本文中的分子技术提供了全面数据。在特定标记时代中，最新一代和第三代平台分别代表了最大的文章份额，分别占43篇（21.3%）和35篇（17.3%）。相比之下，第二代（24篇；11.9%）、第一代（18篇；8.9%）和常规方法（14篇；6.9%）代表了总体积中较小但基础性的份额。这些数据表明，最新一代和第三代最常应用于育种计划，表明植物育种领域正迅速向先进的高分辨率基因组学演进。
#### 分类学分布与性状优先级
本文使用的文章的分类学分布显示出对主要气候抗逆作物的强烈关注。文章在不同作物类型和性状优先级之间的分布差异显著（图4C）。谷类作物在特定作物相关文献中占据主导地位，有72篇文章，紧随其后的是常规发现（68篇）。牧草作物也在综述中占据了相当大的部分，有53篇文章，表明其在基因组学研究中的增长。相比之下，豆科作物和其他作物代表了总体积中较小的份额，分别有3篇和6篇文章。
这种分类学分布进一步体现在文献中特定性状的优先顺序上。虽然常规发现构成了大多数被引用的研究（127篇，62.9%），但专门性状集中在显著关注产量稳定性和营养品质上，占44篇文章（21.8%）。另一方面，非生物胁迫性状（24篇，11.9%）比生物胁迫（7篇，3.5%）更常被关注（图4D）。这些表明，本文讨论的基因组学和育种研究主要以主要谷类和牧草作物为中心，显著强调通过增强产量和营养品质来解决粮食安全问题。
#### 育种应用与性状特定技术
文献根据其主要的育种应用以及特定性状中技术世代的具体整合进行了分类（图5E和F）。如图5E所示，常规信息（71篇）和遗传多样性研究（60篇）构成了被综述研究的支柱。在专门的育种应用中，QTL定位领先，有22篇文章，而现代高分辨率技术如基因组编辑（17篇）和GWAS（13篇）也显示出显著代表性。其他分子育种工具，包括MAS（12篇）和整合的组学方法（7篇），完善了应用组合。
这些育种应用与世代革命之间的关系通过标记世代与性状焦点的相互作用得到了进一步展示。常规发现与常规发现标记类别显示出最强的相关性（56篇），其次是第三代（21篇）和第二代（21篇）。值得注意的是，专注于产量稳定性和营养品质的研究高度依赖于最新一代（22篇）和第三代标记（10篇）（图5F）。这表明最先进的工具主要被部署用于推动生产力和品质相关的应用。
### 讨论
#### 多样性分析与表征的重要性
理解多样性分析与表征对于提高植物生产力至关重要。这使得开发诸如更高产量以及对生物和非生物胁迫的抗性等理想性状成为可能，这些性状可以作为育种计划中的亲本系。通过鉴定特定性状与遗传标记之间的关联，研究人员显著加速了育种进程。此外，系统性的表征保护了有价值的种质资源和独特等位基因，这些资源和基因可能因城市化、气候变化、现代栽培品种以及随时间推移的变化而流失，对于缓解未来挑战至关重要。这种方法能够鉴定出具有更优营养和产量抗逆性的基因型，以应对新兴胁迫，如极端温度、降雨稀少和其他不可预测的环境影响。这促进了精准农业实践，提高了农业效率，加强了农民对气候变化的抵御能力，并为全球粮食安全和家庭生计做出贡献。
#### 分子标记与标记辅助选择的定义与历史
标记是可用作可见特征、DNA序列或生化特性的分子或特征，它们被用作识别和选择遗传特性的标志，并有助于加速育种计划。分子标记的技术基础奠定于1970年代和1980年代早期凝胶电泳和限制性片段长度多态性的出现，用于发现DNA片段和遗传变异性。分子标记是特定的核苷酸序列，有助于识别基因组内的变异，使育种者能够研究个体的遗传特性。标记辅助选择（MAS）利用这些工具基于基因型数据而非观察到的表型来选择所需性状。尽管MAS的概念可以追溯到1923年，但由于效率提高和检测成本下降，其采用在近期加速。MAS代表了育种的一个重大演进，提供了一种可靠的遗传操作手段，以减轻环境变异并加速气候抗逆性品种的开发。
#### 分子标记在气候抗逆作物改良中的作用
干旱和半干旱地区覆盖了全球陆地面积的41%，那里的气候变化通过气温升高、降雨不规律以及病虫害爆发严重威胁着粮食安全。这些干扰降低了产量和营养，尤其是在雨养系统中。为了解决这些问题，复杂的育种技术如基于遗传标记的选择、全基因组选择、数量性状定位和基因组编辑对于开发气候抗逆作物至关重要。与传统的表型选择不同，分子标记允许育种者在成熟前就在DNA水平上鉴定耐旱、耐热和抗病等性状。在过去的二十年里，这些标记已成功鉴定并导入了主要主粮作物中与干旱适应性相关的数量性状位点（QTL）。这种精准性通过提供开发优良品种所需的效率和多功能性，转变了作物改良模式。
现代标记因其高多态性、共显性遗传和成本效益而日益普及。它们广泛应用于主要禾本科物种，包括珍珠粟、高粱、玉米、水稻、大麦和小麦。除了谷类作物，它们还用于分析牧草如象草、罗兹草、木豆（Sesbania sesban）、布菲草（Buffel）和狗牙根种质资源的遗传多样性、群体结构和全基因组关联研究。通过将育种从视觉选择转变为精准的基因组选择，分子标记确保了为全球粮食和饲料安全所必需的气候抗逆性主粮和牧草的开发。
#### 植物育种计划中的分子标记类型
表型选择本质上耗时、成本高且对环境变异敏感。为了克服这些限制，通过特定位点的等位基因变异而非可观察性状来鉴定的DNA标记，在现代育种中变得不可或缺。这些标记促进了标记辅助选择（MAS），将育种从试错方法转向知识驱动的策略。历史上，分子标记从第一代（RFLP）演变为第二代基于PCR的标记（RAPD、AFLP、SSR、ISSR、STS、SCAR、PSSC和CAPS）以及第三代平台如SilicoDArT和SNP。高精度工具，包括GWAS、QTL和CRISPR-Cas，代表了最新的演进，提供了更高的分辨率和可扩展性。每种标记系统在多态性、基因组丰度和技术要求方面有所不同，影响了其在牧草和粮食作物中的应用。
历史上曾被认为是主要主粮专属的分子育种，已扩展到未充分利用的物种。这种扩展在2020年代末基于SSR的对高粱草属（Andropogon gayanus）的首次研究以及早在1993年对狗牙根（Cynodon）的开创性DNA扩增指纹图谱（DNA amplification fingerprinting）应用中得到强化。在复杂的物种如狗牙根中，高通量平台如DArTSeq为从低拷贝基因组区域生成数千个标记提供了经济高效的解决方案。总体而言，分子标记为早期世代筛选和知识产权保护提供了强大框架，确保了气候适应性的育种工作能够满足快速变化环境中全球对食物和饲料不断增长的需求。
##### 限制性片段长度多态性（RFLPs）标记
兴起于1980年代的限制性片段长度多态性（RFLP）是开创性的基于DNA的遗传标记。RFLP使用限制性内切酶在特定回文序列处检测多态性。然而，该技术劳动强度大，需要大量高质量的基因组DNA以及包括酶切和电泳在内的复杂工作流程。虽然已被现代技术大幅取代，但RFLP在资源有限环境中用于候选基因研究仍然有用。
历史上，RFLP为许多气候抗逆作物提供了基础遗传信息。在狗牙根中，它们用于构建第一个连锁图谱，并区分引起狗牙根白叶病的植原体菌株。在珍珠粟中，RFLP促成了第一个遗传连锁图谱的构建，并鉴定出了与霜霉病抗性和耐旱性相关的等位基因。另一个整合了353个RFLP和65个SSR标记的图谱在不同杂交组合中推进了基因组理解。类似地，RFLP也为其他气候抗逆的C4作物的性状发现做出了贡献：在高粱中，它们帮助定位了与持绿性状相关的七个连锁群和四个与花后耐旱性相关的QTL；在玉米中，它们鉴定了与钾胁迫响应、耐热性和世代稳定性相关的位点。这些应用突显了RFLP在揭示抗逆遗传基础方面的历史重要性。为了解决RFLP的技术局限性，随后开发了基于PCR的标记，如随机扩增多态性DNA（RAPD）。
##### 随机扩增多态性DNA（RAPDs）标记
RAPD标记是基于聚合酶链式反应（PCR）的工具，使用短（通常10至12个核苷酸）的随机引物扩增随机的DNA片段。对于非模式物种的一个主要优势是RAPD不需要事先的基因组序列知识。由于与早期技术相比的简单性和成本效益，RAPD已广泛应用于植物遗传学中的品种鉴定、遗传图谱构建和生物多样性评估。然而，显性遗传和对实验条件的高度敏感性通常限制了RAPD的可重复性。该方法包括DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳和分析结果条带模式，这些模式通常揭示个体间大量的多态性。
尽管存在这些限制，RAPD已有效地评估了关键干旱作物的遗传多样性。例如，在狗牙根物种中，RAPD鉴定了伊朗材料间的显著遗传变异以及‘Tifdwarf’和‘Tifgreen’基因型的品种特异性条带。虽然Roodt等人使用RAPD在南非收集的材料中检测到了品种内变异，但其他研究指出RAPD的分辨率低于AFLP。在珍珠粟中，12个RAPD引物在20个和21个精英基因型中分别显示出显著的多态性和中度遗传分化。为了克服RAPD的可重复性问题，同时保持高分辨率，研究人员转向了扩增片段长度多态性（AFLP）。
##### 扩增片段长度多态性（AFLPs）标记
扩增片段长度多态性（AFLP）是一种高分辨率的标记系统，结合了RFLP的可靠性和RAPD的高效性。AFLP通过使用选择性PCR扩增限制性片段，在无需事先序列知识的情况下生成可重复的基因组指纹图谱。AFLP工作流程包括DNA提取、双酶切、接头连接、严格选择性扩增以及通过电泳分离片段以揭示广泛的多态性。该方法因其能够从少量DNA中同时分析大量标记而受到重视。尽管主要是显性标记，但AFLP具有高度可重复性且更易于使用，这对于QTL定位、多样性分析和确定遗传关系至关重要。
在牧草如狗牙根中，AFLP已成功地划分了遗传结构和地理聚类。在狗牙根中，Wu等人使用443个多态性AFLP标记分析了28个狗牙根材料，揭示非洲材料具有最大的遗传变异，而欧洲材料则最具差异性。类似地，对43个韩国狗牙根生态型的AFLP分析验证了高多态性（87.8%）和广泛的遗传相似性（0.42至0.92，平均0.64），突显了它们的育种潜力。除了牧草物种，AFLP还验证了本土知识系统；例如，来自珍珠粟地方品种的分子证据证实了农民关于动态种子交换的报告，显示88%的遗传多样性存在于群体内部。这些应用强调了AFLP作为群体结构分析、高密度遗传图谱构建以及连接科学与传统农业知识的稳健工具的作用。虽然AFLP标记高效，但需要通过共显性遗传来区分纯合子和杂合子，这促使了从AFLP到简单重复序列（SSR）的过渡。
##### 简单重复序列（SSRs）或微卫星标记
简单重复序列（SSR）是共显性的、基于PCR的标记，由2-6个碱基对的串联重复序列组成（例如，(GT)
n或(AAT)
n）。它们因其高多态性、可重复性和精确的基因组定位而备受重视。SSR分析通常包括DNA提取、引物设计、PCR扩增和可视化，然后进行数据解释。虽然SSR开发需要事先的序列信息且成本可能较高，但自1990年代以来，其可靠性已使其成为遗传图谱构建、QTL鉴定和标记辅助选择（MAS）的常用工具。
在狗牙根物种中，SSR已被证明非常有效，可用于鉴定数千个基因组标记并揭示高基因型内变异。例如，54个SSR标记在19个狗牙根材料中鉴定了618个多态性片段，显示了高基因型内变异（94%），并区分了17个遗传上不同的实验系。此外，在特兰斯瓦尔狗牙根（C. transvaalensis）中开发的981个基因组SSR为该物种的连锁图谱构建提供了第一个共显性SSR资源，其中34个SSR标记与耐寒性状相关联。SSR还能够进行精确的品种鉴定；11个多态性SSR标记有效区分了22个品种，并从32个狗牙根基因型中鉴定了44个品种特异性DNA条带。在多倍体中，249个多态性SSR揭示了复杂的二体遗传，并定位了5个与地面覆盖度相关的QTL。
同样，SSR已被用于其他禾本科物种如珍珠粟的遗传结构研究，其中91个多态性SSR标记将22个珍珠粟基因型分为四个类群。后续研究使用42个SSR证实了32个基因型之间的高遗传方差。总之，这些研究强调了SSR在评估遗传结构、阐明多倍体育种遗传以及促进各种禾本科物种的QTL定位和MAS方面的长期价值。最近，对高通量可扩展性和更低成本的需求促成了SNP和DArTSeq标记的开发。
##### 单核苷酸多态性（SNPs）标记
单核苷酸多态性（SNP）是单碱基DNA变异，代表植物基因组中最丰富的遗传变异形式，通常每100-300个碱基对发生一次。这些双等位基因标记，分为转换（如C ? T或G ? A）或颠换（如C ? G或A ? T）变异，能够进行高通量基因分型和精确的遗传模式追踪。自1998年首次应用于人类疾病基因关联研究以及小麦（每20 bp一个SNP）和玉米（每70 bp一个SNP）等主要谷类作物以来，SNP已成为MAS、QTL定位、GWAS和基于CRISPR编辑的必备工具。
在禾本科物种中，基于SNP的研究革新了基因组学理解。在狗牙根中，利用多达37,496个SNP构建的高密度遗传图谱成功地将群体聚类为不同的遗传组，并鉴定了关键性状的遗传标记。此外，使用360万个DArTSeq衍生的SNP，GWAS定位了82个与耐盐性相关的候选基因，包括染色体2B、1B和4A上的RAP2—2、F14D7.1和CNG通道。类似地，在珍珠粟中，SNP推动了饲草品质和抗逆性的进步。研究人员定位了755个SNP来鉴定跨环境的饲草品质QTL，并利用435,000个SNP检测了544个标记-性状关联，其中33个基因与161个基因型中的蛋白质和氨基酸含量强烈相关。这些进步展示了SNP在揭示复杂性状和提高气候抗逆农业育种效率方面的威力，允许精确鉴定候选基因和性状相关位点。虽然SNP提供高分辨率的共显性数据集，但DArTSeq平台，特别是SilicoDArT，为孤儿作物的标记发现提供了更具成本效益的替代方案。
##### 多样性基因分型测序（DArTSeq）和SilicoDArT标记
多样性基因分型测序（DArTSeq）平台利用下一代测序（NGS），同时生成两种类型的数据集：SilicoDArT标记（限制性片段的存在/缺失，为显性）和DArTSeq SNP（共显性，无需事先序列信息）。SilicoDArT标记于2000年代初以水稻基因组为模型开发，已成为包括珍珠粟、小麦和高粱在内的多种作物物种中遗传多样性分析、连锁图谱构建和标记辅助选择的必备工具。在狗牙根物种中，这些标记展示了卓越的可重复性（99.77%），生成了超过285,000个标记，其中30,505个表现出99.77%的可重复性，使研究人员能够解析复杂的群体结构并纠正物种误分类。
类似的成果已在主要牧草中得到证实。在象草中，DArTSeq产生了超过116,190个SilicoDArT标记，在多态性（>0.25）方面优于共生成的SNP，并能够鉴定出35个与关键饲草性状相关的QTL。在罗兹草中，59,164个SilicoDArT标记定义了三个不同的类群，与基于SNP的数据集具有很强（82%）的共表征相关性，证实了其可靠性。此外，在珍珠粟中结合208个SilicoDArT和96个SSR标记，在一个F6 106重组自交系（RILs）群体中成功定位了位于LG3上的锌和铁QTL，突显了它们在生物强化育种中的效用。因此，SilicoDArT标记和DArTSeq平台为分析遗传多样性、鉴定性状关联以及加速气候抗逆牧草和粮食作物的快速育种计划提供了强大、经济高效的框架。
#### 分子标记的应用
##### 标记辅助选择（MAS）
标记辅助选择（MAS）是一种变革性的分子育种策略，通过利用与QTL连锁的DNA标记实现对可遗传性状的间接选择。通过允许在表型表达之前进行选择，MAS提高了精准度，加速了育种周期，并改善了仅通过表型难以选择的复杂性状。这种方法的准确性主要取决于标记与目标基因之间的连锁强度。
MAS已在多种作物物种中成功应用。例如，在小麦中，14个SSR标记成功筛选了25个基因型以鉴定耐热性状；而在高粱中，三个特定的SSR标记（Xtxp43、Xtxp211和Xtxp51）尽管存在环境互作，但对耐冷苗活力表现出一致的效果。在玉米中，主要的QTL qMrdd8通过MAS成功导入了七个感病玉米自交系；在大麦中，五个SSR（EBmac871、HVS3、Bmac209、Bmac67和Bmag0006）为鳞翅目病害提供了清晰的共显性区分。
在牧草作物中，MAS克服了由复杂基因组、多倍性和生殖障碍带来的历史性挑战。在狗牙根中，高密度遗传图谱的构建和31个抗病基因同源物的鉴定，实现了对病原体的稳健选择。具体而言，MAS成功开发了精英品种如‘Tifway’、‘Tifgreen’、‘Tifton 85’和‘Coastal’。同样，在珍珠粟中，测序基因分型（GBS）鉴定了在多个连锁群上与粗蛋白（CP）和消化率显著相关的稳定SNP，为MAS驱动的品质改良提供了明确的靶点。标记辅助回交（MABC）在性状导入方面也被证明是有效的。例如，来自供体系8638的耐旱QTL被转移到HBL 11的雄性亲本中，以开发HHB 226，在BC3F1代恢复了80%的轮回亲本基因组。此外，这些在象草、兵豆（lablab）、苜蓿和罗兹草等物种中的进步，突显了MAS作为现代气候智慧育种计划中必不可少的工具。
##### 数量性状位点（QTL）定位
数量性状位点（QTL）是与可测量的表型性状（如重量或高度）相关的特定染色体区域，受多基因效应和环境影响。与由少数基因调控的质量性状不同，数量性状表现出梯度变化，在遗传上更难以解析。QTL定位利用分子标记，在由双亲杂交或多样化种质资源收集产生的分离群体中，将基因型与这些复杂表型相关联。通过将QTL分类为主要效应（对性状有主要影响）、微效（影响较小）和上位性（不同QTL相互作用，意味着一个QTL的效应取决于其他QTL的存在/缺失），育种者可以优先考虑高影响力的基因组区域用于MAS和MABC，以改善通常为多基因且不太适合传统表型选择的性状，包括生物量产量、营养品质、水分利用效率和胁迫耐受性。
狗牙根物种，通常是普通狗牙根（C. dactylon），是牧草QTL研究的一个范例。例如，为普通狗牙根构建的一个包含3544个标记（3322个SNV和222个SSR）的高密度遗传图谱，分布在18个连锁群上，分辨率为0.41 cM，为MAS和全基因组组装提供了基因组“GPS”。该框架能够早期鉴定耐盐性的优异等位基因，但其效用受到高分离扭曲率（64.08%）的阻碍，这是由于在自然异交物种中使用S1群体造成的。同样，为非洲狗牙根（C. transvaalensis）构建的第一个高密度遗传图谱鉴定了4个与建植率相关的QTL，其中在LG3上检测到的主要QTL解释了32.7%的表型变异，有助于在早期选择覆盖速度快的基因型。然而，该属中高分离扭曲率（44.5%）和环境可塑性需要多环境验证。
其他气候抗逆牧草物种的进步展示了QTL定位的效用。在全球象草种群中，研究人员鉴定了35个与生物量产量和水分利用效率相关的QTL区域，包括在A01上一个与分蘖数一致的主要QTL，以及在B06上与总干重和水分利用效率共定位的区域。在珍珠粟中，LG02上的一个霜霉病抗性主要QTL解释了60%的表型变异，能够快速开发抗性基因型。尽管该技术解决了病圃筛选的问题，但其主要的育种限制仍然是病原型特异性，因为高毒力病原菌可以克服单一位点抗性，需要叠加多个QTL以获得持久保护。LG3上与锌和铁共定位的QTL分别解释了36%和19%的表型方差，为珍珠粟的同步生物强化提供了高影响力。然而，育种应用可能会受到高分离扭曲率（78%）和环境不稳定的阻碍，因为许多微量营养素是环境特异性的，而非跨季节稳定。QTL定位通过将基因组区域与关键性状联系起来，提高了选择精度并加速了育种周期。
##### 全基因组关联研究（GWAS）
全基因组关联研究（GWAS）是一种基于标记的选择方法，利用来自多样化种质资源的数千个标记来鉴定控制数量性状的位点，无需进行跨越整个基因组的控制杂交。与通常涉及双亲杂交100-5000个个体的连锁QTL定位不同，GWAS在数千个多样化材料中检查标记-性状关联，利用历史重组来实现精细尺度的基因组分辨率。GWAS通过鉴定高分辨率的标记-性状关联，提供精确的分子靶点。这种方法简化了在育种历史有限的牧草作物中研究复杂遗传架构的过程。高质量参考基因组的可用性和低成本基因分型扩展了GWAS在牧草作物中的应用。此外，高通量表型技术能够在大规模实施中实现快速性状测量。
在狗牙根中，高密度的基因组资源已经解构了复杂的抗逆和生长架构。一项里程碑研究使用360万个SNP和染色体级别的狗牙根‘A12359’基因组，鉴定了82个与耐盐性状相关的候选基因，突出了三个基因（RAP2-2、CNGC1和F14D7.1）作为关键调控因子。作为补充，Singh等人使用37,496个SNP，在206个狗牙根材料中发现了与四种形态性状相关的显著标记-性状关联。同样，在对91份野生狗牙根材料的研究中，GWAS和加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定了一种新的β-葡萄糖苷酶基因CdBGLU31，该基因与植物高度和吲哚-3-乙酸（IAA）含量显著相关。
GWAS也已成功地在其他粮食和牧草作物中鉴定了候选基因，包括牧草作物中的象草、兵豆和布菲草，以及粮食作物中的珍珠粟、小麦、大麦和豇豆。在象草中，GWAS定位了关键农艺性状的候选基因。Habte等人报告了88个DArTSeq标记与一个巴西埃塞俄比亚种质材料中的总干重和代谢能相关。在兵豆中，一项针对142份材料在埃塞俄比亚多样化环境中的研究，鉴定了与关键农艺性状（如株高和总干重）相关的显著SNP和K-Mers。同样，布菲草的GWAS揭示了78个与生物量和饲料品质性状相关的标记-性状关联，其中几个标记在谷子（Setaria italica）基因组的染色体7和9上共定位。
在珍珠粟等粮食作物中，全基因组分析揭示了38,579个与抗病性、耐旱性和耐热性相关的基因，为水分胁迫环境提供了基础性基因组资源。GWAS还发现了与农艺表现和抗逆性相关的重要标记-性状关联，包括对独脚金（striga hermontheica）的抗性、50%开花天数、穗长和千粒重。此外，在小麦和玉米中的GWAS鉴定了与籽粒矿物质含量和微量元素转运蛋白（如ZmHMA3和ZIP3基因）相关的稳定位点。在大麦和豇豆中，GWAS揭示了与胁迫信号传导和光保护相关的干旱响应位点和候选基因。因此，这些鉴定的候选基因作为高分辨率发现引擎，用于精确的CRISPR介导的基因组编辑，加速了精英气候抗逆栽培品种的开发。
##### 成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR），通常是CRISPR-Cas系统，源自原核生物的免疫机制，已成为一种变革性的基因编辑技术（图8）。自2012年以来，CRISPR实现了精确、高效和位点特异性的DNA修饰，在多功能性和成本效益方面超越了早期的基因编辑工具如转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）和锌指核酸酶（ZFNs）。CRISPR系统根据其效应蛋白架构分为两类：1类系统（I、III和IV型）利用多亚基Cas蛋白复合物，而2类（II、V和VI型）使用单个大效应蛋白来介导DNA或RNA切割。2类核酸内切酶，特别是Cas9和Cas12a，是最常见和最广泛应用于植物基因工程的。值得注意的是，与Cas9（31.7%）相比，Cas12a在丝状真菌中表现出更高的编辑效率（86.5%），这主要是因为它能够处理自己的向导RNA（gRNA），从而简化了多重编辑。
CRISPR已成功应用于多种作物物种以增强农艺性状（表2）。在谷类作物中，CRISPR介导的编辑通过抗倒伏性使苔麸的产量损失减少了25%；在小麦中，降低了麸质含量，同时改善了抗病性和籽粒品质；在水稻和大麦中，增强了胁迫响应性和籽粒营养品质。对牧草豆科的影响更为显著；例如，在苜蓿中，通过CRISPR/Cas9介导的MsFTa1基因敲除，开花延迟多达21天，导致鲜重增加78%，干重增加76%，同时降低了木质素和纤维含量，提高了粗蛋白和矿物质浓度，尤其是在茎中。同样，在四倍体苜蓿中敲除PALM1基因产生了具有多叶表型的突变体，粗蛋白含量增加了21.5%，而在红三叶草中通过CRISPR/Cas9破坏IFS1基因，显著降低了异黄酮水平而不影响结瘤。
尽管在谷类、豆科和模式禾本科如狗尾草（Setaria viridis）中取得了这些成功，但CRISPR在狗牙根物种、珍珠粟和高粱草等牧草中的直接应用仍主要处于概念验证阶段。然而，此处鉴定的高优先级候选基因为未来的基因组编辑工作提供了清晰的分子蓝图。在狗牙根中，增强耐盐性的验证靶点包括RAP2—2、CNGC1和F14D7.1，而CdBGLU31与植物高度和IAA含量相关。此外，CdHEMA1基因的农杆菌介导过表达已证明了光合效率的提高，突显了未来基于CRISPR优化该通路的潜力。同样，在珍珠粟中，与铁和锌代谢相关的基因组区域，如pglYSL2、pglZIP2、pglZIP8、pglNRAMP2和pglFER1家族基因，是生物强化的主要靶点。这些鉴定的位点代表了从标记辅助选择向精确的、知识驱动的基因组增强过渡的重要且尚未开发的机会。
### 分子标记在植物育种中的挑战与机遇
将分子标记与尖端技术整合，已通过精准、高效和加速的遗传改良彻底改变了植物育种，但仍存在重大挑战。实验室基础设施和专业人员的高昂经济成本常常限制了小规模项目的采用。在技术上，标记辅助选择（MAS）的可靠性常因遗传重组而受损，这破坏了标记与目标基因之间的连锁，并在选择过程中导致假阳性。此外，标记发现与实际育种之间的鸿沟，常被称为“过渡期鸿沟”或“基因型-表型鸿沟”，阻碍了广泛采用，尤其是在孤儿和未充分利用的作物物种中。这一挑战之所以加剧，是因为许多农艺重要性状是多基因的，受复杂的基因相互作用影响，使得单个标记难以捕捉一个性状的完整遗传架构。标记在不同遗传背景间有限的可转移性需要昂贵且耗时的验证，而标记-性状关联常因基因型与环境互作（G x E）而降低标记的一致性。
相反，将多组学（包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学）与高通量表型分析（HTP）整合，提供了前所未有的机遇来弥合这一鸿沟。这种整合已通过将分子特征直接与实时物理响应联系起来，在气候抗逆作物开发中取得了可衡量的进步，使研究人员能够绕过传统的育种延迟，并显著提高选择准确性。反映这一潜力，一项针对大量玉米自交系的研究表明，通过随机森林模型整合2496个SNP、133种代谢物和46种基于图像的现象性状，将产量预测准确性（R2）从0.32提高到0.43。同样，在联合模型中结合转录组和基因组数据，与单一层级方法相比，将预测准确性从0.64提高到0.68，成功鉴定了六个开花时间基因。此外，苜蓿中多组学的综合应用实现了0.85的生物量预测准确性，在两年内鉴定出优良基因型。多组学还解码了营养品质下降，将其与HemA基因下调和氨基酸含量从23.51%降至20.49%相关联。
到2030年，这些多组学的进步将通过预测复杂数量性状的表现，为解决全球粮食安全问题提供关键机遇。这种能力使得将多个目标基因“叠加”到单一栽培品种中成为可能，这几乎不可能单独使用传统表型方法实现。因此，整合的组学显著提高了选择精度并加速了育种周期，有效地绕过了等待表型成熟来开发气候抗逆且营养丰富的作物的需要。
### 分子系统及其应用的SWOT分析
分析优势、劣势、机会和威胁，分层级呈现于表4中。
### 结论与研究方向
分子标记通过为开发气候抗逆作物提供精准高效的策略，已实质性地推动了植物育种。从早期基于RFLP的图谱到现代由DArTSeq驱动的全基因组扫描，这些工具加速了性状发现、种质表征和优异等位基因的导入。MAS、QTL和GWAS等技术有助于揭示抗旱性、养分利用效率、抗病性、产量和饲草品质等复杂性状的遗传基础，尤其是在未充分利用和多倍体物种中。此外，CRISPR-Cas系统现在允许对已验证的候选基因（例如，RAP2—2、CdBGLU31和pglYSL2）进行直接编辑。尽管取得了这些进展，但技术、资金和生物障碍仍然限制了分子育种的潜力，尤其是在孤儿作物和资源有限的环境中。弥合基因型到表型的鸿沟需要整合多组学、高通量表型分析和参与式育种，以超越当前的限制。
本综述的范围和方法学考量在解释其发现时需要予以承认。分析完全依赖于英文文献，排除了相关的非英文出版物。虽然豆科作物被纳入综合分析，但相对于谷类和牧草，它们代表性不足；具有气候抗逆性的多年生树种未涉及，这反映了文献集中在定义的搜索参数内。此外，许多气候抗逆性状是多基因的，并受到G x E互作的强烈影响，表明此处报告的标记-性状关联在没有多环境验证的情况下可能无法在不同环境中持续一致。承认这些限制突显了进行全面文献搜索、为代表性不足的物种提供专门的基因组资源以及标准化多环境试验以加强分子育种见解的转化可靠性的必要性。
#### 优先发展经济高效的基因组资源
研究必须专注于为未充分利用的物种建立开放获取的参考基因组，并采用多重基因分型平台如DArTSeq，以最小化小型项目的经济壁垒。
#### 弥合基因型到表型的鸿沟
未来的工作应整合多组学，包括表型组学和参与式育种方法，以在真实田间条件下验证标记的可靠性。
#### 本地化的G x E验证
为确保选择准确性，研究应优先进行标记-性状关联的多环境验证，以覆盖多样化的本地气候，从而解释显著的基因型与环境互作（G x E）。
#### 分散式能力建设
建立区域基因组中心和简化生物信息学流程，以减少资源有限环境中对昂贵、专业外部基础设施的依赖。
#### 气候智慧型基因金字塔
利用基因组选择将多个抗逆性和营养基因叠加到单一栽培品种中，以保护全球粮食系统免受加速气候变化的影响。
