负载SARS-CoV-2刺突蛋白衍生分支肽的DDA(二甲基双十八烷基铵)阳离子脂质体肺部黏膜免疫平台的初步评价

《Frontiers in Immunology》：Preliminary evaluation of a DDA cationic liposome-based pulmonary mucosal immunization platform carrying a SARS-CoV-2 spike-derived branched peptide

　　

摘要：目前的注射型疫苗针对呼吸道病毒能有效诱导系统性免疫，但在建立黏膜部位的有效防御方面存在不足，最终无法完全阻断病毒感染和传播。开发能同时激活黏膜免疫和系统性免疫的新型免疫策略至关重要。本研究构建了一种基于二甲基双十八烷基铵(dimethyldioctadecyl ammonium, DDA)阳离子脂质体的肺部黏膜免疫纳米疫苗平台，以SARS-CoV-2 Spike蛋白衍生的分支肽为模型抗原，采用体外树突状细胞(dendritic cell, DC)活化实验及小鼠肺部黏膜免疫模型系统评估其免疫效果。结果显示，制备的制剂粒径均匀(约101 nm)，Zeta电位为正(+42.67 mV)，包封率高于80%。该制剂有效刺激DC成熟，诱导血清中高水平抗原特异性IgG抗体及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IgA抗体，显著促进活化T/B细胞增殖及肺组织驻留记忆T(tissue-resident memory T, TRM)细胞形成。机制研究表明，疫苗在肺部长时间滞留并随后被检出分布于纵隔淋巴结(mediastinal lymph node, MLN)，伴随DC活化相关表型升高，协同激活黏膜与系统性免疫应答。综上，本研究为DDA脂质体剂型经肺部黏膜给药后的免疫原性潜力提供了初步的概念验证证据，但未来研究尚需补充体内对照组及对抗原特异性免疫应答更严格的验证。

论文解读：负载SARS-CoV-2 Spike衍生分支肽的DDA阳离子脂质体肺部黏膜免疫平台的初步评价

研究背景与目的

呼吸道传染病（由流感病毒、呼吸道合胞病毒RSV及SARS-CoV-2等引起）是全球重大公共卫生负担。现有注射疫苗虽可控制重症及死亡，但难以在病毒入侵的首要门户——呼吸道黏膜建立有效免疫屏障，常无法完全阻断无症状感染及传播。黏膜免疫系统含分泌型IgA(sIgA)及组织驻留记忆T细胞(tissue-resident memory T cell, T_RM)，可在病原体入口处快速防御。然而，黏膜物理屏障（如黏液纤毛清除）阻碍抗原滞留摄取，且安全有效的黏膜佐剂匮乏。脂质纳米颗粒特别是阳离子脂质体可增强抗原稳定性、促进与黏膜表面相互作用及抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)摄取。其中DDA(二甲基双十八烷基铵, dimethyldioctadecyl ammonium)可通过静电作用吸附带负电的黏膜表面及APC膜，促进抗原摄取与提呈，是具潜力的疫苗载体与佐剂。CpG ODN作为Toll样受体9(TLR9)激动剂可促进DC成熟及Th1型应答。本研究旨在构建并初步评价一种结合DDA阳离子脂质体与CpG ODN佐剂的肺部黏膜免疫平台，以SARS-CoV-2 Spike蛋白S_450–471区域来源的分支肽为模型抗原，探究其理化表征、体外免疫细胞活化能力及体内诱导黏膜与系统性免疫应答的效果及机制。

主要关键技术方法

研究人员采用薄膜分散-水化法制备负载SARS-CoV-2 Spike衍生分支肽(S_450–471)的DDA阳离子脂质体(S_450–471@DDA-Lipo, 脂质组成为DSPC:DDA摩尔比约80:20 mol%)，CpG ODN 1018体外或体内给药前新鲜混合。使用动态光散射及透射电镜进行制剂理化表征（粒径、多分散指数PDI、Zeta电位、形态、包封率）。体外采用BALB/c小鼠来源骨髓源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)及骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage, BMDM)进行细胞活化（共刺激分子CD80/CD86、MHC II及培养上清IFN-γ）及CCK-8细胞活力检测。体内使用10–12周龄雌性BALB/c小鼠，分别经鼻滴入或经口气管插管行气管内(intratracheal, IT)肺部免疫（第0、14、28天，含200 μg抗原+10 μg CpG/只），设PBS对照、单纯皮下(subcutaneous, SC)免疫及SC+IT联合免疫组；末次免疫后采集血清、鼻腔灌洗液(nasal lavage fluid, NLF)、BALF、肺及脾脏；ELISA检测抗原特异性IgG/IgG1/IgG2a（血清）及IgA（BALF/NLF），总IgA(BALF)；流式细胞术分析肺及脾脏淋巴细胞亚群（活化B/T细胞、中央记忆T_CM、效应记忆T_EM、CD4⁺/CD8⁺T_RM样细胞定义为CD44⁺CD69⁺CD103⁺或CD44⁺CD69⁺CD11a^hi，经S_450–471肽体外再刺激），纵隔及颈/腋窝淋巴结免疫细胞；以DiR荧光标记脂质体行活体成像及离体器官荧光定量评估体内生物分布与滞留。

研究结果

3.1 S_450–471@DDA-Lipo的制备与表征

制备所得S_450–471@DDA-Lipo呈球形，平均粒径约101.6±4.16 nm，PDI 0.271±0.032，Zeta电位+42.67±3.50 mV，包封率>80%。4℃储存60天内粒径从约101.6 nm增至138.1 nm但仍属纳米尺度，表明制剂在前30天较稳定。

3.2 S_450–471@DDA-Lipo+CpG可有效刺激树突状细胞活化

与PBS组相比，S_450–471@DDA-Lipo+CpG处理显著上调BMDC表面CD80⁺MHC II⁺及CD86⁺MHC II⁺表达百分比，也显著上调BMDM的CD86表达，并显著提升BMDC上清IFN-γ水平(P<0.05)；游离肽或游离CpG无此显著效果。CCK-8显示各浓度下BMDC存活率无显著下降，无细胞毒性。

3.3 肺部黏膜免疫诱导的抗体应答强于鼻黏膜免疫

比较鼻内滴入与气管内肺部免疫（第0、14天，第42天取材），肺部免疫组血清抗原特异性IgG滴度(log₂3600±894.4, P<0.0001 vs 鼻组)及BALF抗原特异性IgA滴度(log₂16.80±13.97, P<0.05 vs 鼻组)均显著高于鼻黏膜免疫组，表明该制剂更适合肺部黏膜途径给药。

3.4 适应性免疫应答

3.4.1 黏膜免疫触发肺部更强的局部细胞与体液免疫

与对照组比，单纯IT组BALF抗原特异性IgA显著升高(P<0.001)，BALF总IgA在各组间仅有轻微差异。肺组织活化B细胞比例IT组及SC+IT组显著升高(P<0.01及P<0.0001 vs 对照)；经肽再刺激后，IT及SC+IT组肺内活化CD4⁺T、CD8⁺T细胞及CD4⁺/CD8⁺T_RM样细胞比例均显著升高(P<0.0001 vs 对照及SC组)，而SC组无此变化。提示肺部黏膜免疫特异性促进局部黏膜IgA及肺驻留记忆T细胞形成。

3.4.2 联合黏膜与皮下免疫增强系统性体液应答并诱导混合型Th1/Th2相关细胞因子谱

血清抗原特异性总IgG在IT、SC+IT、SC组均较对照显著升高；IgG1亚型仅在SC+IT组达显著差异，IgG2a亚型亦仅SC+IT组达显著差异。血清IFN-γ水平SC+IT组较对照显著升高(P<0.05)，Granzyme B仅SC组较对照显著升高，IL-4及IL-10各组间无显著差异。提示该平台诱导了混合Th1/Th2偏向但伴较强Th2组分的系统性免疫谱。

3.4.3 疫苗激发后脾细胞经肽再刺激的T细胞记忆表型

脾脏总B细胞、活化B细胞比例及各中心记忆T_CM(CD44⁺CD62L⁺)、效应记忆T_EM(CD44⁺CD62L^?) T细胞比例在各免疫组与对照组间均无统计学显著差异，无法得出接种途径依赖的脾脏记忆T细胞分化结论。

3.5 S_450–471@DDA-Lipo肺部黏膜递送促进肺滞留及引流淋巴结活化

活体成像显示DiR标记脂质体气管内给予后在肺部滞留可达10天，离体成像证实主要定位于肺并随时间累积于纵隔淋巴结(mediastinal lymph node, MLN)。与对照比，IT组肺内CD11c⁺CD86⁺DC及CD11c⁺CD86⁺MHC II⁺DC比例显著升高(P<0.05及P<0.001)，MLN中CD4⁺及CD8⁺T细胞增殖显著升高(P<0.05)，而SC组无此MLN活化，提示肺滞留抗原经局部DC活化并迁移至引流MLN启动适应性免疫。

讨论与结论

研究人员讨论指出，本工作为主动构建并初步评价DDA脂质体肺部黏膜肽疫苗平台的概念验证研究。所制脂质体粒径<200 nm利于跨黏液屏障，强正电荷有助于与负电黏膜表面及DC静电作用延长滞留并促进摄取。体外S_450–471@DDA-Lipo+CpG有效促DC成熟(MHC II、CD80、CD86上调)及IFN-γ分泌。体内肺部（vs鼻）免疫诱导更强血清IgG及BALF sIgA，且肺局部活化B/T细胞增多、CD4⁺/CD8⁺T_RM样细胞比例升高，制剂在肺滞留>10天并被MLN摄取伴随DC活化及MLN T细胞增殖，说明肺递送可促进局部黏膜免疫微环境并协同激活系统性应答。血清IgG1与IgG2a均升高伴IFN-γ上升提示混合Th1/Th2型应答。局限性包括未设空载脂质体及单独抗原/佐剂体内对照、未做中和抗体及病毒攻毒保护实验、未测体外抗原释放动力学、未做血管灌注严格区分组织驻留T细胞、脾脏记忆T细胞无组间差异可能需更大样本验证、未进行肺组织病理学检查。

结论翻译：总之，本研究提供了一种基于DDA阳离子脂质体的肺部黏膜免疫平台负载SARS-CoV-2 Spike衍生肽抗原可诱导黏膜及系统性免疫应答的概念验证。结果支持该平台的免疫原性及机制潜力，但对保护效力的解读应谨慎。未来需补充中和抗体活性测定、体内病毒攻毒保护实验、抗原释放动力学分析、组织学评估及细胞特异性摄取分析以进一步完善该免疫平台的评价。本研究发表于《Frontiers in Immunology》。