《Journal of Controlled Release》：Achieving the goldilocks zone of lung-targeted mRNA delivery with a charge-steric optimized quantum dot-lipid system for pulmonary fibrosis therapy
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林王|王建宇|徐中兴|程雪|曹哲坤|陈琳莉|张金生|沈辽|隋欣|罗媛|杨俊|王永安中国人民解放军军事医学科学院，北京市海淀区太平路27号，邮编100850摘要利用核酸药物治疗肺部疾病在靶向特异性和转染效率方面面临重大挑战。尽管信使RNA（mRNA）疗法具有巨大潜力，但其临床应用需
林王|王建宇|徐中兴|程雪|曹哲坤|陈琳莉|张金生|沈辽|隋欣|罗媛|杨俊|王永安
中国人民解放军军事医学科学院，北京市海淀区太平路27号，邮编100850
摘要
利用核酸药物治疗肺部疾病在靶向特异性和转染效率方面面临重大挑战。尽管信使RNA（mRNA）疗法具有巨大潜力，但其临床应用需要先进的递送系统。本研究受到第一性原理思维的启发——将mRNA递送过程分解为其基本的物理化学要求——构建了一种简化的脂质系统用于肺部靶向mRNA递送，该系统使用阳离子脂质1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）实现肺部靶向，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG2000）通过空间位阻增强生物安全性，以及丙氨酸衍生的碳量子点（Ala-CQDs）进一步提高转染效率。全面的安全性评估证实，DSPE-PEG2000有效降低了DOTAP引起的细胞毒性、溶血、凝血功能障碍和器官损伤。机制研究表明，Ala-CQDs通过形成肺趋向性蛋白冠层并促进内体逃逸来增强肺部靶向和转染效率。与已报道的肺部选择性器官靶向脂质纳米颗粒（Lung-SORT LNP）相比，这种精简的递送系统仅保留了功能必需的成分，不仅使肺部靶向转染效率提高了约40倍，而且生物相容性显著改善，毒性也降低。该系统能够同时装载基质金属蛋白酶13（MMP13）mRNA和酪氨酸激酶抑制剂尼达尼布（Nin），制备出纳米药物mMMP13@Lipo(Nin)/Ala-CQDs。作为治疗肺纤维化的联合方案，它在促进胶原蛋白降解、恢复肺功能及减轻肺泡损伤方面表现出有效性。总体而言，这项工作建立了一种高效且生物安全的脂质系统，为基于mRNA的肺部疾病治疗提供了新的策略。
引言
肺纤维化（PF）是一种进行性且致命的间质性肺病，其特征是细胞外基质不可逆积累和肺实质结构扭曲[1]，[2]。目前的标准治疗方法，包括吡非尼酮和尼达尼布[3]，主要通过减缓功能衰退来提供有限的治疗效果，但无法逆转已形成的纤维化病变或再生功能性肺泡单位[3]，[4]。信使RNA（mRNA）疗法代表了一种革命性的方法，有望通过原位表达能够调节纤维化途径或促进组织修复的蛋白质来解决这一根本性治疗缺口[5]，[6]，[7]，[8]，[9]，[10]。然而，裸mRNA在肺部递送过程中面临两个主要生物学障碍：易受酶降解以及由于其负电荷而无法有效穿过细胞膜[11]，[12]，[13]。尽管脂质纳米颗粒（LNPs）已成为克服这些障碍并实现mRNA转染的强大工具[14]，[15]，[16]，[17]，[18]，但传统的LNP配方在全身给药后表现出强烈的肝脏靶向分布模式[19]。这种主要的肝脏积累严重限制了它们在治疗肺部疾病（20）中的应用。因此，开发专门的肺部靶向LNP系统对于充分发挥mRNA疗法在严重呼吸系统疾病（如PF[21]、肺癌[22]和严重呼吸道感染[23]，[24]）中的潜力至关重要。
目前关于肺部靶向mRNA递送的研究主要遵循两种策略：从头合成新型可电离脂质[25]，[26]，[27]，或将阳离子成分（如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）掺入标准LNPs[28]，[29]。前者缺乏通用的预测设计规则，依赖于广泛的筛选；后者虽然增加了配方复杂性，但已成为肺部靶向mRNA递送的基准，并确立了肺部纳米颗粒设计的关键指导原则：正表面电荷决定了肺部积累[30]。这一原则虽然实现了肺部靶向，但也引发了显著的毒性问题，因此需要在疗效和潜在细胞毒性之间找到平衡[31]，[32]，[33]。因此，未来肺部靶向mRNA递送系统的开发取决于找到一种“恰到好处”的配方，以最佳方式兼顾肺部靶向功能和生物安全性。
尽管报道的肺部选择性器官靶向脂质纳米颗粒（Lung-SORT LNPs）在肺部靶向方面具有实用性，但它们存在几个显著缺点，包括成分过于复杂、制备过程繁琐、阳离子脂质的固有细胞毒性和残留有机溶剂的安全风险。因此，这些缺点要求对这些LNPs进行重新评估和重新设计。受到第一性原理思维的启发，我们通过提出三个基本问题重新评估了当前的Lung-SORT LNP系统：这种LNP配方中的所有成分是否真的对肺部递送不可或缺？用于制备肝脏靶向系统的复杂微流控方法是否一定适用于肺部等不同器官？为一个器官建立的设计原则是否可以直接应用于另一个器官？这些关键问题需要系统性地重新研究，因为它们挑战了设计器官特异性递送系统的基础。
在这项研究中，我们开发了一种简化、高效且生物安全的肺部靶向mRNA递送系统，以应对肺部靶向mRNA递送的挑战。基于DOTAP/1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG2000）配方构建了装载mRNA的脂质体，并进一步用丙氨酸衍生的碳量子点（Ala-CQDs）进行修饰作为活性增强剂（图1A）。该系统通过吸附目标特异性血浆蛋白在纳米颗粒表面形成独特的冠层，从而实现高效的肺部靶向（图1B）。然后，对该精简的肺部靶向mRNA递送系统进行了全面评估，并与报道的Lung-SORT LNP在转染效率和安全性方面进行了比较。为了展示其治疗潜力，该系统被用于制备同时装载基质金属蛋白酶13（MMP13）mRNA（编码降解细胞外基质（ECM）的关键酶，以减轻纤维化重塑[7]）和尼达尼布的肺部靶向纳米药物。随后在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中评估了其疗效（34）。
部分摘录
确定肺部靶向的关键成分
为了研究影响LNPs肺部靶向效率的关键成分，我们使用微流控方法系统地拆解了已报道的肺部LNP——Lung-SORT LNP（28）（图2A），依次省略了各个组分（图2B）。完整的LNP（LNP I）以及不含1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和胆固醇（Chol）的配方（LNP III）在肺部均表现出相似的高荧光素酶表达水平，表明结构脂质
结论
本研究提出了一种合理设计的双组分简化脂质系统，用于高效且安全的肺部靶向mRNA递送。虽然阳离子DOTAP提供了必要的肺部靶向能力，但DSPE-PEG2000的加入通过空间位阻降低了其相关毒性；系统评估证实，该系统减少了溶血、凝血功能障碍和器官损伤，同时保持了转染效率。创新性地引入Ala-CQDs作为关键配方成分
CRediT作者贡献声明
林王：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。王建宇：方法学、研究、数据分析、概念化。徐中兴：方法学、数据分析。程雪：软件、数据分析。曹哲坤：可视化、数据分析。陈琳莉：数据分析。张金生：数据分析。沈辽：数据分析。隋欣：数据分析。罗媛：数据分析。杨俊：撰写
资助
本研究未获得公共部门、商业部门或非营利组织的任何特定资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者声明在准备本手稿过程中未接受任何外部帮助。
