基于聚集诱导发光的异构体工程用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌脓肿的诊疗学研究

《Aggregate》：Isomer Engineering of NIR-II Aggregation-Induced Emission for the Theranostics of MRSA-Induced Abscess

　　

抗菌素耐药性危机的加剧对全球公共卫生构成了紧迫威胁。传统光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）受限于氧依赖性和有限的光穿透深度，这可能削弱其在深部脓肿缺氧微环境中的治疗效果。在此，研究人员报道了一种位置异构体工程策略，将硫杂蒽（thioxanthene, THX）骨架转化为具有延伸至第二近红外（second near-infrared, NIR-II）窗口荧光和双模态治疗能力的聚集诱导发光分子（aggregation-induced emission luminogens, AIEgens）。理论和光物理研究表明，对位构型异构体（Ph-p-THX）比其间位类似物（Ph-m-THX）表现出更小的能隙和更高的振子强度。这些电子特性提供了更有利的单重态-三重态能级排列，从而在与脓肿微环境相关的缺氧条件下，支持涉及三重态的I型为主混合活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成。同时，缩小的能隙和增强的光捕获能力有助于实现高效的光热转换。因此，Ph-p-THX实现了NIR-II成像引导的治疗，并在体内展现出对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）脓肿的优异抗菌活性。总体而言，该研究突出了位置异构化作为一种有效策略，用于优化基于THX的AIE光敏剂以用于抗菌诊疗应用。

多重耐药（multidrug-resistant, MDR）病原体目前在医院和社区环境中普遍存在，其持续性感染通常由快速的适应性进化和生物膜相关耐药性所维持。加剧这一挑战的是，真正新型抗生素类别的研发管线有限，随着耐药性的持续传播，可靠的选择越来越少。这种情况凸显了开发新型非抗生素治疗策略的迫切需求，特别是光激活方法，如光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）和光热疗法（photothermal therapy, PTT）。在此背景下，聚集诱导发光（aggregation-induced emission, AIE）分子已成为一个有前景的抗菌应用诊疗平台。AIE发光分子（AIE luminogens, AIEgens）能在生物环境中产生明亮荧光，实现对微生物定位的高对比度可视化。此外，基于AIE的光敏剂（photosensitizers, PSs）可被设计为在光照射下产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）和局部热量，从而通过多靶点的氧化和热损伤实现广谱细菌灭活。其中许多分子对多种MDR细菌表现出微摩尔级别的抗菌能力。

尽管具有这些显著优势，当前AIEgens在对抗细菌脓肿，特别是那些由耐药菌株引起的脓肿的治疗应用中，仍然是一个严峻挑战。脓肿微环境在病理上是复杂的。它不仅粘稠且富含蛋白质，而且由于细菌强烈呼吸和炎症细胞消耗的共同作用，其特征在于有限的氧气供应。由于大多数报道的AIEgens主要通过依赖氧气的II型能量转移途径产生单线态氧，其在这种缺氧条件下的疗效会显著降低。因此，迫切需要能够通过稳健的I型电子转移机制运行的AIEgens，以克服这些微环境限制，理想情况下与光热消融协同作用以进一步破坏细菌防御。此外，脓肿病变的深部位置和光散射特性需要特定的成像要求。因此，在第二近红外（second near-infrared, NIR-II）窗口内的荧光成像被认为能够改善组织穿透性并实现治疗实时引导。然而，构建这样一种多功能的小分子AIEgen仍然是一个重大瓶颈。在单一分子骨架内集成I型为主混合ROS生成、高效光热转换和延伸至NIR-II窗口的发射，同时保持低暗毒性，是极具挑战性的。

位置和立体异构体工程已成为一种精密工具，用于微调AIE体系的光物理和光治疗特性。例如，开创性研究已经表明，取代基的空间排列可以深刻影响超分子聚合、荧光效率和用于抗真菌治疗的ROS生成途径。最近，氰基位置异构被证明可以调控I型ROS生成和细胞器靶向能力。这些发现共同表明，细微的结构扰动可能导致激发态行为的根本性转变。THX部分被广泛认为是一个具有强吸电子能力的大平面电子受体，这使其成为构建高效AIE活性PSs的有前景的构建单元。然而，位置异构化的影响在很大程度上是骨架特异性的，其在单一THX基骨架内同时协调NIR-II发射、I型偏向ROS生成和光热转换的潜力尚未被探索。

受这些考虑的启发，研究人员在此报道了一种针对THX骨架的位置异构体工程策略，以应对治疗复杂感染的巨大挑战。通过精确调整连接拓扑结构，开发了两种异构AIEgen光敏剂，Ph-m-THX和Ph-p-THX，成功地将NIR-II荧光（延伸至1000 nm以上）与强大的光动力和光热活性相结合。研究结果表明，Ph-p-THX中的对位取代优化了分子内电子耦合和激发态能级排列，触发了向I型为主混合ROS生成结合高效非辐射光热衰减的根本转变。这种独特的光物理特性旨在克服传统PDT的氧依赖性，确保即使在病理复杂的脓肿微环境中，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和多重耐药大肠杆菌（E. coli）也具有强大的杀菌效果。基于其优越的体外性能，Ph-p-THX在小鼠脓肿模型中的NIR-II成像引导协同治疗潜力得到了进一步验证，它显著加速了病变消退和组织修复。总之，该研究确定位置异构化作为一种高效的战略方法，用于合理设计多功能、微环境适应性的AIE治疗剂。

**异构体工程策略概述**。本研究基于THX基位置异构体进行分子设计（方案1A）。间位异构体（Ph-m-THX）和对位异构体（Ph-p-THX）通过位置异构工程从参考化合物Ph-THX衍生而来。在660 nm激光照射下，AIEgens产生ROS，导致细菌氧化损伤和高效杀灭（方案1B）。在小鼠MRSA脓肿模型中，进行NIR-II成像引导的光治疗评估。在660 nm激光照射下，Ph-p-THX减少细菌负担，促进病变消退，并减轻炎症反应，表现为TNF-α和IL-1β表达降低（方案1C）。

**AIEgens构建与光物理性质表征**。基于位置异构工程策略，研究人员合理设计并合成了三种小分子光敏剂，即Ph-THX、Ph-m-THX和Ph-p-THX（方案1A）。这三种分子均包含一个稠合THX单元作为关键功能构建块。在分子设计中，首先将一个THX单元引入苯环以得到参考化合物Ph-THX。在此基础上，将另一个THX单元进一步连接到苯环的间位或对位，分别生成两种位置异构衍生物Ph-m-THX和Ph-p-THX。值得注意的是，该设计保持了相同的分子骨架，同时选择性地改变连接位置和取代拓扑，从而实现了对分子内构象和电子耦合的位置编码调控。这种位置异构工程策略提供了一个受控平台，用于阐明细微结构变化如何影响AIE行为、ROS生成效率和后续的光动力抗菌活性。这些化合物的合成路线详见方案S1，其化学结构通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）得到了完全确认。

研究人员系统地研究了Ph-THX、Ph-m-THX和Ph-p-THX在二甲基亚砜（DMSO）中的紫外-可见（UV-vis）吸收和光致发光（PL）光谱。如图1A所示，三种化合物在可见光区（虚线）均表现出明确的吸收带，并伴有从可见光延伸到近红外区域的宽发射谱（实线）。值得注意的是，这些光敏剂的发射谱显示出延伸至1000 nm以上的长波尾，表明其发射特性延伸至NIR-II窗口。与Ph-THX相比，位置异构衍生物Ph-m-THX和Ph-p-THX在吸收和发射上均表现出明显的红移，这可归因于改变的连接拓扑诱导的增强的分子内电子耦合。与Ph-m-THX相比，Ph-p-THX表现出更显著的红移，表明对位连接架构实现了更有效的π共轭和更低的激发态能量。为研究其AIE行为，研究人员在体积分数（φ_tol）逐渐增加的DMSO/甲苯混合物中记录了PL光谱。对于Ph-THX（图S10）、Ph-m-THX（图S11）和Ph-p-THX（图S12），发射强度随φ_tol的增加而逐渐增强，显示出典型的AIE特性。这一趋势在图1B中得到进一步量化，其中所有三种AIEgens的相对发射强度（I/I₀）均随甲苯分数的增加而上升，在高φ_tol条件下达到最大值。

理论计算进一步进行，以更深入地了解结构-性质关系并证实实验发现。如图1A所示，三种光敏剂的实验摩尔吸光系数（ε）呈现从Ph-THX到Ph-m-THX再到Ph-p-THX的清晰上升趋势。值得注意的是，Ph-p-THX表现出显著的高ε值，接近30,000 M^?1 cm^?1，与其异构体相比，光捕获能力显著增强。这一实验发现得到了跃迁振子强度分析的有力支持，其中Ph-p-THX具有最大的总振子强度（2.517），显著超过Ph-m-THX（2.094）和Ph-THX（0.995）（图1C和表S1）。振子强度的这种增加与其对位连接拓扑所实现的吸收强度增强一致。此外，计算的偶极相关参数，包括偶极矩（μ）、偶极矩变化（Δμ）和跃迁偶极矩（μ_tr），总结在表S2中。Ph-p-THX相对较大的μ_tr值进一步支持其强大的电子跃迁能力，与其增强的吸收行为一致。此外，前线分子轨道（FMO）和能级分析揭示，Ph-p-THX具有最窄的最高占据分子轨道-最低未占据分子轨道（HOMO-LUMO）能隙（ΔE_g = 2.289 eV），显著低于Ph-THX（ΔE_g = 2.674 eV）和Ph-m-THX（ΔE_g = 2.658 eV）（图1D–F）。Ph-p-THX的HOMO和LUMO电子密度在共轭骨架上的广泛离域最小化了激发能的能量惩罚，从而为其显著的光谱红移和卓越的光捕获效率提供了坚实的理论基础。

受其窄能隙和延伸至NIR-II区域的发射特性的鼓励，研究人员进一步评估了Ph-m-THX和Ph-p-THX的NIR-II荧光成像性能。在660 nm激光激发下，两种AIEgens均显示出清晰的NIR-II荧光信号，其中Ph-p-THX显示出比Ph-m-THX更强的荧光（图1G）。这一趋势得到了浓度依赖性荧光测量的进一步支持，其中Ph-p-THX在测试浓度范围内始终表现出更高的NIR-II发射强度（图S13）。为评估在组织模拟散射条件下的信号穿透性，使用了具有不同厚度的脂肪乳剂层作为光学模型。如图1H所示，两种AIEgens的NIR-II荧光信号随着脂肪乳剂厚度的增加而逐渐衰减，而Ph-p-THX在更大深度保留了更强的荧光。定量分析进一步证实了Ph-p-THX与Ph-m-THX相比信号衰减更慢且保留的荧光强度更高（图S14）。这些结果表明，对位连接拓扑提高了NIR-II成像的亮度和在散射条件下的信号保留率。

除了荧光成像之外，窄带隙AIEgens典型的高效非辐射衰减途径赋予了它们有前景的光热特性。因此，研究人员系统地研究了这些分子的光热性能。图1I、J中的光热图像以及图S15和S16中显示的浓度依赖性加热曲线表明，在660 nm激光照射下，Ph-m-THX和Ph-p-THX均表现出随浓度增加而增强的光热加热效果。与热图像一致，在相同浓度下，Ph-p-THX表现出比Ph-m-THX更显著的温升。此外，功率密度依赖性加热曲线进一步显示，Ph-m-THX和Ph-p-THX的光热效应均随照射功率密度的增加而增强，而在相同的照射条件下，Ph-p-THX始终表现出比Ph-m-THX更强的温升（图S17和S18）。

为进一步量化它们的光热转换能力和稳定性，研究人员连续监测了两种分子在20 μM浓度下的温度变化。如光热加热和冷却曲线所示（图1K），Ph-p-THX溶液在照射后温度迅速升高，并达到比Ph-m-THX更高的平台温度。基于这些数据，计算出Ph-m-THX和Ph-p-THX的光热转换效率（η）分别为53.79%和59.51%（图S19和S20），表明Ph-p-THX具有更高效的光热转换。此外，可逆的加热/冷却曲线表明两种AIEgens均具有良好的光热稳定性，没有明显的光漂白或降解。总而言之，对位连接架构增强了NIR-II荧光亮度、散射条件下的信号保留率和光热转换效率。这种协同作用主要源于Ph-p-THX卓越的光捕获能力，它将更多的分子布居到激发态。此外，根据能隙定律，缩小的能隙促进了非辐射弛豫途径，从而增强了光热输出。同时，Ph-p-THX中的对位连接在实现更好分子共轭以限制分子内运动以增强辐射跃迁的同时，产生了更小的空间位阻效应。鉴于这些有利的激发态特性和窄能隙，研究人员接下来研究了异构体工程是否也能增强ROS生成效率并调控光化学途径。

**Ph-m-THX和Ph-p-THX的ROS生成能力与机制检测**。基于上述优化的电子耦合和光捕获能力，研究人员使用2',7'-二氯二氢荧光素（DCFH）作为ROS指示剂，系统评估了这些AIEgens的ROS生成效率。在660 nm激光照射下，监测了Ph-THX、Ph-m-THX、Ph-p-THX和临床参考物二氢卟吩e6（Chlorin e6, Ce6）的荧光响应（图2A）。Ce6和Ph-THX组仅表现出有限的荧光增量，而Ph-m-THX和Ph-p-THX组触发了约1000倍的剧烈荧光增强。这一结果突出了位置工程的效果。具体而言，在间位或对位安装额外的THX单元显著增强了THX骨架的光敏化能力。值得注意的是，在相同条件下，Ph-p-THX和Ph-m-THX的功能是比临床基准Ce6更有效的PSs。

为阐明这种增强性能的潜在机制，研究人员分析了激发态能级（图2B和表S3）。Ph-m-THX和Ph-p-THX具有显著减小的第一激发单重态（S₁）与附近三重态（T_n）之间的能隙，这种构型已知有利于系间窜越（intersystem crossing, ISC）过程。这种高效的S₁→T_n跃迁促进了长寿命三重态的布居，这对于驱动I型和II型光反应至关重要。最终，Ph-p-THX优越的ROS生成性能可归因于协同效应：其强大的摩尔消光系数（最大化光捕获）和最有利的单重态-三重态能级排列（最大化ISC效率）的结合，两者均由对位连接拓扑所实现。

为进一步明确ROS生成的种类，研究人员采用了一系列代表性化学探针。对于II型ROS单线态氧（¹O₂），使用9,10-蒽基双（亚甲基）二马来酸（ABDA）和单线态氧传感器绿色（SOSG）作为测试指示剂，Ph-m-THX和Ph-p-THX表现出比商业光敏剂Ce6更慢的¹O₂生成速率（图2C、D和图S21）。随后，通过二氢罗丹明123（DHR123）和羟基苯基荧光素（HPF）评估I型ROS。DHR123荧光增强遵循Ph-p-THX > Ph-m-THX > Ce6的顺序，表明这些位置异构体倾向于产生超氧阴离子（O₂^·?）（图2E）。此外，使用HPF评估了羟基自由基（·OH）的生成，证实Ce6和THX异构体在照射下均产生·OH（图2F）。总之，这些基于探针的检测证明Ph-m-THX和Ph-p-THX通过I型为主混合ROS生成途径发挥作用。电子自旋共振（ESR）光谱提供了光触发ROS生成的直接证据（图2G–I）。在自旋捕获剂存在下，在黑暗中观察到可忽略的信号。在660 nm激光照射下，使用5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）检测到·OH和超氧化物相关物种的特征性自由基加合物信号。同时，使用2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP）确认了¹O₂的形成，其在氧化后产生特征性的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基（TEMPO）信号。这些结果证实了多种ROS物种的产生，与上述基于探针的检测结果一致。

总之，理论计算和光物理研究表明，位置芳基工程成功地将THX骨架转化为一类新型高效PSs。Ph-m-THX和Ph-p-THX均通过I型和II型双重途径高效生成ROS，并明显以前者为主。在异构体中，Ph-p-THX表现出最高的ROS生成效率，使其成为高性能抗菌PDT的有前景的候选物，特别是在缺氧相关的脓肿微环境中。

**Ph-m-THX和Ph-p-THX的体外抗菌活性评估**。鉴于它们高效的ROS生成，研究人员通过菌落形成实验评估了Ph-m-THX和Ph-p-THX的抗菌活性。针对革兰氏阳性（G⁺）细菌，包括金黄色葡萄球菌（S. aureus）、MRSA和耐万古霉素屎肠球菌（VREfs），两种AIEgens均表现出显著的光激活抗菌活性（图3A–D和图S22–S25）。Ph-m-THX在低于1 μM浓度下对S. aureus和MRSA几乎没有暗毒性，而Ph-p-THX在0.5 μM时引起明显的暗抑制。值得注意的是，两种AIEgens对VREfs也表现出强大的光激活抗菌活性，在660 nm激光照射下，随浓度升高，细菌存活率显著降低（图S24和S25）。照射后，两种AIEgens在1–2 μM浓度下对G⁺细菌实现了超过99%的杀灭。相比之下，革兰氏阴性（G^?）细菌大肠杆菌（E. coli）和多重耐药大肠杆菌（MDR E. coli）敏感性较低，只有在较高浓度下，光照和黑暗条件之间才出现明显的差异（图3E–H）。在照射下，Ph-m-THX对大肠杆菌表现出更强的抗菌活性，而Ph-p-THX对MDR E. coli略微更有效，特别是在中高浓度下（图S26和S27）。细菌活力进一步通过SYTO 9/碘化丙啶（PI）染色可视化，结果显示在黑暗条件下细菌死亡极少，但在照射后出现强烈的PI阳性信号，特别是在Ph-p-THX处理组（图3I、J）。此外，MRSA生长曲线分析进一步支持了两种AIEgens的光增强抗菌活性。在黑暗条件下，持续抑制生长24小时需要相对较高的浓度，表明其固有毒性有限，而在660 nm激光照射下，2 μM的任一AIEgen使MRSA增殖延迟超过12小时，4 μM在24小时监测期内几乎完全抑制了细菌生长（图S28）。

总之，这些结果表明两种位置异构体均具有强大的光激活抗菌活性和广谱功效，对G⁺细菌表现出更高的敏感性，并且Ph-p-THX始终表现出更优的性能。在确认了其强大的抗菌活性之后，研究人员接下来试图了解这些AIEgens如何与细菌细胞相互作用，以及哪些分子特征可能是其杀菌效果的基础。

**细菌定位与初步相互作用分析**。在确认了强大的光激活抗菌活性之后，研究人员接下来研究了细菌定位并进行了初步的相互作用分析，以了解Ph-m-THX和Ph-p-THX如何与细菌细胞结合以及哪些分子特征可能是其抗菌效果的基础。将MRSA和MDR E. coli与Ph-m-THX或Ph-p-THX在PBS中共孵育30分钟，随后使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像。如图4A、B所示，两种AIEgens在两种细菌菌株中均产生强烈的红色荧光。通过与Hoechst 33342共染色和合并通道分析，证实了它们与细菌的有效结合。

基于化学结构，研究人员接下来使用分子对接评估了两种AIEgens与DNA-旋转酶复合物（PDB ID: 7MVS）的结合能力。对接结果预测Ph-m-THX和Ph-p-THX在DNA-旋转酶复合物中具有可行的结合模式，预测的结合能分别为-8.12和-18.68 kcal/mol（图4C、F）。相互作用图谱显示了与周围碱基和氨基酸残基的多重非共价接触，包括电荷辅助的π相互作用以及π–π（T形）、π–孤对和π–烷基接触（图4D、G）。

随后，进行了DAPI置换实验以探测Ph-m-THX和Ph-p-THX的DNA关联能力。将任一异构体逐渐加入到预形成的DAPI-DNA复合物中时，DAPI的荧光发射呈浓度依赖性降低，表明两种AIEgens均能干扰DAPI-DNA的结合（图4E、H）。同时，紫外-可见吸收滴定进一步显示，随着DNA的加入，Ph-m-THX和Ph-p-THX表现出浓度依赖性的光谱变化，支持它们在溶液中与游离DNA的相互作用（图S29和S30）。

总之，两种位置异构体均能有效染色MRSA和MDR E. coli，而分子对接、DAPI置换和紫外-可见DNA滴定分析表明它们在体外有可能与DNA-旋转酶/DNA复合物以及游离DNA相互作用。这些相互作用，加上膜结合和通透性依赖的细胞摄取，可能部分贡献于它们在细菌内的积累。

**Ph-m-THX和Ph-p-THX细菌膜结合的分子动力学分析**。为阐明位置异构化是否影响细菌膜结合，研究人员使用代表性的金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）膜模型进行了全原子分子动力学（MD）模拟。轨迹分析包括配体-膜质心（COM）距离、脂质接触、累积功、脂质特异性接触分数以及相对于膜法线的分子取向（图5）。

在金黄色葡萄球菌膜模型中，Ph-m-THX和Ph-p-THX均接近并与膜结合，但它们的结合后行为差异更明显（图5A–E）。Ph-p-THX在轨迹的中后期显示出更小的COM距离，并伴有更持久的低角度取向状态，表明在初始接触后具有更持久的膜结合构象（图5A、E和图S31）。尽管两种异构体主要与1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油（POPG）相互作用，但Ph-p-THX表现出更大的四油酰心磷脂单阴离子（TOCL1）参与度和略高的后期累积功，表明与G⁺膜形成了更平衡且持久的相互作用网络（图5C、D和图S32、S33）。

在大肠杆菌膜模型中，两种异构体之间的差异不太明显，更适合描述为不同的结合后重组，而非简单的强弱膜结合差异（图5F–J）。Ph-m-THX保持了较小的后期COM距离，而Ph-p-THX更频繁地采用低角度倾斜构象，并在后期表现出略高的累积功（图5F、H、J和图S34）。脂质特异性接触分析进一步显示，Ph-m-THX表现出相对平衡的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（POPE）/POPG接触模式，略偏好POPG，而Ph-p-THX表现出更强的POPE参与（图5I和图S35、S36）。

总之，MD模拟表明两种位置异构体均可有效结合细菌膜，而连接拓扑主要调控结合后的重组过程，而非决定膜结合是否发生。这种膜依赖性差异在金黄色葡萄球菌模型中更为明显，其中Ph-p-THX形成了更持久的膜结合状态，为其略微更强的抗菌性能提供了分子水平的解释。

**Ph-m-THX和Ph-p-THX诱导细菌损伤的机制研究**。为阐明结构损伤，研究人员首先通过电子显微镜检查了细菌形态。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，PBS和AIEgens在黑暗条件下处理的MRSA保持光滑、完整的细胞表面。相比之下，在660 nm激光照射下，存在Ph-m-THX或Ph-p-THX会导致显著的形态恶化，其特征是细菌收缩和严重的包膜变形（图6A）。透射电子显微镜（TEM）结果证实了这一点，与PBS和AIEgens在黑暗条件下处理的MRSA相比，显示出显著的包膜破坏和广泛的细胞内紊乱（图6B）。在MDR E. coli中也观察到类似的照射依赖性损伤（图6C、D），包括膜完整性丧失和明显的细胞内破坏，表明光动力损伤在G⁺和G^?细菌中具有广谱性。

为捕获早期膜扰动并提供膜完整性的功能性读数，研究人员接下来使用3,3'-二丙基硫代二羰花青碘（DiSC3(5))探针监测了MRSA和MDR E. coli中的膜去极化。在两种菌株中，荧光强度呈浓度依赖性增加，并且在激光照射下始终高于黑暗条件（图6E–H）。然而，去极化的程度与激光照射下观察到的近乎定量的杀伤不成正比，这表明膜去极化本身不太可能完全解释杀菌活性，可能涉及额外的损伤机制。

为评估氧化应激，研究人员使用DCFH定量了MRSA和MDR E. coli中的ROS产生。在没有激光照射的情况下，ROS信号保持在基线水平。在激光照射下，两种细菌模型中的DCFH荧光急剧增加（图6I–L）。一致地，定量分析证实，与相应的黑暗对照组相比，照射后的MRSA和MDR E. coli中细胞内ROS水平显著升高，如图6M、N所示，代表性荧光图像见图S37。这些数据表明，光照射驱动了显著的细胞内ROS积累，支持氧化应激是细菌杀伤的主要贡献者。

研究人员接下来评估了细菌基因组DNA是否构成光动力损伤的下游靶点。琼脂糖凝胶电泳显示，在660 nm激光照射下，MRSA和MDR E. coli的基因组DNA在Ph-m-THX或Ph-p-THX处理后比在黑暗条件下表现出更显著的断裂（图6O）。与直接的AIEgens-DNA相互作用一致，荧光开启实验显示在没有DNA时发射弱，但在加入DNA后信号增强（图S38）。这些结果表明，光激活的AIEgens可以在G⁺和G^?细菌模型中诱导DNA损伤，尽管不同菌株和化合物之间的损伤程度有所不同。总之，电子显微镜、膜去极化、细胞内ROS检测和DNA损伤实验共同支持ROS驱动的多靶点光动力损伤是两种AIEgens的主要杀菌机制，其中Ph-p-THX通常表现出更强的效果。

**Ph-m-THX和Ph-p-THX的体外生物相容性评估**。研究人员使用小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在黑暗和660 nm激光照射条件下评估了AIEgens的细胞毒性和细胞定位。CCK-8实验显示，在0-5 μM浓度范围内，Ph-m-THX在两种条件下对NIH 3T3细胞仅引起适度的抑制，在10 μM和660 nm激光照射下观察到最大效应，对应22.15%的抑制率（图7A）。相比之下，Ph-p-THX在测试浓度范围内在照射下未引起可检测到的活力丧失（图7B）。在HUVECs中，Ph-m-THX和Ph-p-THX在黑暗和光照条件下的活力均保持在80%以上（图7C、D）。NIH 3T3细胞的CLSM成像进一步显示，在2 μM浓度下孵育1小时后，两种AIEgens主要积聚在溶酶体中（图7E），这得到了与LysoTracker强共定位的支持（Pearson系数Ph-m-THX为0.79，Ph-p-THX为0.81）。此外，与阳性组相比，两种AIEgens在所有测试浓度下的溶血活性均可忽略不计（图7F）。总之，两种AIEgens在测试条件下均表现出良好的生物相容性，细胞毒性低且溶血最小。它们主要定位在溶酶体表明溶酶体隔离是其主要的细胞内归宿，与在哺乳动物细胞中观察到的有限损伤一致。

**体内NIR-II成像引导的Ph-p-THX光动力/光热治疗MRSA脓肿**。基于全面的体外结果，Ph-p-THX被选用于BALB/c小鼠皮下MRSA诱导脓肿模型的体内评估（图8A）。在660 nm激光照射下，Ph-p-THX加速了病变愈合，到第7天，治疗组的脓肿明显减少，而PBS治疗的对照组仍存在显著炎症，这通过代表性照片和相应的伤口区域示意图得到直观证明（图8B）。一致地，定量分析显示，在7天观察期内，Ph-p-THX组的脓肿面积显著更小（图8C）。NIR-II荧光成像进一步证实了Ph-p-THX在感染部位的滞留，相对荧光强度随时间逐渐下降（图8D、E）。此外，红外热成像记录了Ph-p-THX组在照射下脓肿部位出现轻微和局部的温度升高（图8F）。这种适度的光热效应可能有助于局部光热治疗活性，而不会对周围健康组织造成明显的热损伤。通过均质化组织的集落形成单位（CFU）计数评估了脓肿组织中的细菌负荷（图8G、H）。与PBS + Laser（PBS + L）组相比，Ph-p-THX + Laser（Ph-p-THX + L）组从第3天开始减少细菌负荷，在测试条件下第5和7天未检测到菌落。在整个研究过程中，各组体重相当（图S39）。主要器官的苏木精-伊红（H&E）染色在Ph-p-THX处理的小鼠中未检测到病理异常（图S40），表明具有良好的体内生物相容性。

为验证体内抗菌功效，研究人员对感染皮肤组织进行了革兰氏染色。如图9A所示，在“PBS + L”组中可以清晰看到密集的G⁺细菌聚集体（绿色箭头指示的深紫色团块），表明严重的细菌定植。相比之下，“Ph-p-THX + L”组表现出极少的细菌残留，与局部MRSA负荷的显著减少一致。此外，第7天的H&E组织病理学评估进一步显示，“PBS + L”组仍以组织破坏为主，伴有广泛的坏死和细菌聚集体，伴随弥漫性炎症浸润。相比之下，“Ph-p-THX + L”组显示出组织修复的特征，包括成纤维细胞增多和明显的新血管形成，同时炎性细胞密度显著降低。一致地，Masson三色染色显示对照组存在充满密集炎性浸润和坏死碎片的明显化脓腔，而Ph-p-THX治疗基本上清除了脓肿，并以肉芽组织和纤维重塑取代，其特征是连续、密集有序的胶原沉积。免疫组织化学（IHC）进一步支持Ph-p-THX治疗后炎症减轻（图9B）。在PBS治疗的对照组中，脓肿边缘观察到显著的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）阳性，而在“Ph-p-THX + L”组中这两种标志物均显著降低，与向修复状态的转变一致。阳性区域的定量分析证实了治疗后TNF-α和IL-1β表达减少（图9C、D）。

总之，Ph-p-THX介导的光疗实现了MRSA的快速清除和脓肿病变的显著加速修复，并伴有炎症细胞因子信号的减轻。重要的是，在测试剂量下未发现明显的全身毒性，支持Ph-p-THX作为安全有效的体内抗菌PS。

**研究结论总结**。总之，研究人员实施了一种位置异构体工程策略来开发具有延伸至NIR-II窗口荧光的THX基AIE光敏剂。通过精确调控芳基连接拓扑，研究人员证明了对位取代衍生物（Ph-p-THX）与其间位类似物和母体骨架相比，表现出显著增强的电子耦合和光捕获效率。这种结构调控有利于I型为主混合ROS生成谱，同时保持良好的光热稳定性。这种自由基偏向的特征，加上温和的光热效应，诱导了多靶点细菌损伤，包括包膜破坏、超微结构紊乱和DNA断裂。除了其体外性能外，Ph-p-THX在测试剂量下表现出良好的生物相容性，并在小鼠脓肿模型中显示出改善的治疗效果。凭借NIR-II荧光成像能力，它通过ROS介导的光动力活性和温和的局部加热加速了病变消退和组织修复，在测试条件下未观察到明显的全身毒性。该研究为对抗深部、微环境受损的细菌感染提供了一个有前景的THX基候选物，并展示了一个代表性案例，表明位置芳基工程可用于调节NIR-II成像引导的双模态抗菌诊疗性能。