《Journal of Extracellular Vesicles》：Metabolic Tagging of Tumour Extracellular Vesicles for Targeted Modulation of Dendritic Cells
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细胞外囊泡（EVs）因其良好的安全性与药代动力学特性，已成为细胞疗法的一种有前景的替代选择。其中，肿瘤EVs在多种癌症类型中显示出作为治疗性癌症疫苗的潜力。然而，如何高效且特异性地将EVs递送至体内主要的抗原呈递细胞——树突状细胞（DCs），仍是一个挑战。研究
细胞外囊泡（EVs）因其良好的安全性与药代动力学特性，已成为细胞疗法的一种有前景的替代选择。其中，肿瘤EVs在多种癌症类型中显示出作为治疗性癌症疫苗的潜力。然而，如何高效且特异性地将EVs递送至体内主要的抗原呈递细胞——树突状细胞（DCs），仍是一个挑战。研究人员报道了一种通过代谢标记在肿瘤EVs表面引入叠氮基团的方法，并利用高效的点击化学将抗DEC205抗体偶联其上。研究表明，叠氮糖可以通过代谢糖工程途径将癌细胞标记上叠氮基团，这些被标记的癌细胞能够分泌带有叠氮标签的EVs。经二苯并环辛炔（DBCO）修饰的抗DEC205抗体成功地与叠氮标记的EVs偶联。与其它免疫细胞相比，抗DEC205偶联的EVs被树突状细胞优先内化，并提升了树突状细胞对EVs内包裹抗原的处理与呈递效率。研究人员进一步证实，与对照组EVs相比，抗DEC205偶联的EVs能够诱导增强的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答和抗肿瘤疗效。本研究为化学标记EVs及向其偶联靶向分子提供了一种简便通用的方法，可用于实现对特定细胞的靶向调控。
肿瘤免疫治疗在过去的二十年里改变了临床癌症治疗的范式，尤其是检查点阻断疗法和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的成功。然而，有限的患者响应率、对实体瘤疗效不佳以及偶尔出现的严重副作用限制了现有免疫疗法的应用。尽管治疗性癌症疫苗的临床成功不如检查点阻断和CAR-T疗法，但其具有在安全的框架下诱导肿瘤长期控制的潜力。癌症疫苗的功能是将肿瘤抗原和佐剂递送至树突状细胞（DCs），即体内主要的抗原呈递细胞，以启动肿瘤特异性T细胞。目前，已开发出多种类型的癌症疫苗，包括DC疫苗、纳米疫苗、生物材料支架疫苗、肿瘤细胞外囊泡（EV）疫苗和mRNA疫苗。其中，肿瘤EV疫苗在临床试验中显示了良好的安全性并能够引发细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答，但其治疗效果仍然有限。肿瘤EV疫苗通过将肿瘤来源的EVs输入体内，随后由DCs摄取和处理EVs内的肿瘤抗原来发挥作用。然而，输入的肿瘤EVs被DCs摄取的效率通常较低，限制了由此产生的CTL应答的效力。这些问题促使了旨在改善肿瘤EVs在体内向DCs递送的靶向策略的发展。为此，DC表面受体如DEC205、Langerin和DC-SIGN已被用于实现向DCs的靶向递送。例如，表面功能化抗DEC205已被证明可以提高DCs对分子和纳米颗粒的摄取。然而，如何高效地将DC靶向配体（如抗DEC205）功能化到肿瘤EVs上仍然是一个挑战。传统的EV修饰方法依赖于将带有羧基的试剂共价偶联到带有氨基的EVs上，或将抗体结合到EVs表面存在的蛋白质上，这些方法受限于每个EV上氨基基团或受体的数量极少。
研究人员近期报道了一种EV代谢标记技术，可以将独特的化学标签（如叠氮基团）引入EVs表面。叠氮糖可以通过代谢糖工程途径用叠氮基团标记肿瘤细胞，而这些被标记的肿瘤细胞可以分泌带有叠氮标签的EVs。这种方法可以在各种类型的细胞的每个EV上引入超过3000个叠氮基团，从而能够通过高效的点击化学将大量带有二苯并环辛炔（DBCO）的货物偶联到EVs上。本研究表明，可以通过代谢标记方法将抗DEC205（αDEC205）偶联到肿瘤EVs上，以开发DC靶向的肿瘤EV疫苗。预期αDEC205偶联的肿瘤EVs在输入体内后，会靶向DCs并被其处理。随后，呈递肿瘤抗原的DCs能够启动抗原特异性的CD8+ T细胞，这些T细胞可以识别并杀死肿瘤细胞。
研究人员首先制备了叠氮标记的EVs（EV-N3）以及αDEC205偶联的EVs（αDEC205-EV）。E.G7-OVA细胞用常见的代谢标记试剂Ac4ManAz处理3-5天后，从培养基中分离EVs。通过离心和尺寸排阻色谱法纯化后，使用DBCO-Cy5验证了EVs表面存在叠氮基团。透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）显示，叠氮标记对EVs的形态和直径无显著影响。通过将αDEC205与DBCO-NHS反应合成DBCO功能化的αDEC205，再与叠氮标记的EVs通过点击化学偶联，成功制备了αDEC205偶联的EVs。流式细胞术分析显示，EV-N3与EV在激活DCs表面标志物（如CD40、CD80、CD86和MHCII）方面无显著差异，表明其免疫原性极低。
随后，研究人员评估了αDEC205偶联的EVs对树突状细胞的靶向能力。将骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）与αDEC205/Cy5偶联的EVs或Cy5偶联的EVs共孵育，流式细胞术分析显示，αDEC205/Cy5-EVs被BMDCs摄取的效率显著高于Cy5-EVs，且这种增强的摄取在不同EVs浓度下均保持一致。在包含DCs、T细胞和E.G7-OVA癌细胞的三细胞共培养体系中，αDEC205/Cy5-EVs同样表现出对DCs的优先摄取。体内实验表明，小鼠皮下注射αDEC205/Cy5-EVs后，其引流淋巴结中Cy5+ DCs的比例显著高于注射Cy5-EVs组，而Cy5+巨噬细胞的比例无显著差异。这些结果证实，αDEC205偶联的EVs在体外优先被DCs摄取，在体内也能增强向DCs的递送。
接着，研究人员研究了αDEC205偶联的EVs对DCs激活和抗原呈递的影响。用αDEC205偶联的E.G7-OVA来源的EVs、未修饰的EVs或单独的αDEC205处理BMDCs后，αDEC205偶联的EVs处理组BMDCs的CD86和MHCII激活标志物表达水平更高，并且通过主要组织相容性复合体I类（MHCI）呈递的OVA蛋白CD8表位SIINFEKL的水平也更高。将经不同处理的BMDCs与CFSE标记的SIINFEKL特异性CD8+ T细胞（OT-I）共培养，αDEC205偶联的EVs预处理的BMDCs能显著促进OT-I细胞的增殖。此外，研究人员还探索了αDEC205偶联的EVs对DCs的剂量依赖性激活效应。通过在偶联步骤中使用不同浓度的DBCO-αDEC205来制备αDEC205偶联的EVs。结果显示，随着αDEC205输入浓度的增加，BMDCs上CD86和MHCII的表达水平总体上升，随后共培养实验中OT-I细胞的增殖率也随之提高。而非偶联的αDEC205与EVs的混合物在大多数条件下对DCs的激活和OT-I细胞的刺激作用甚微。这些实验证明了αDEC205偶联的EVs能够靶向DCs，诱导DCs的增强激活，并改善DCs对EVs内抗原的处理和呈递。
在评估CTL应答和抗肿瘤疗效方面，研究人员首先在预防性肿瘤模型中进行了评估。小鼠在第1天皮下注射αDEC205偶联的EVs、单独的EVs或PBS，在第6、9和15天收集外周血单核细胞（PBMCs），用SIINFEKL肽进行体外刺激后，通过流式细胞术分析SIINFEKL四聚体+ CD8+ T细胞和干扰素γ（IFN-γ）+ CD8+ T细胞的比例。结果显示，与EVs组相比，αDEC205偶联的EVs处理组在CD3+CD8+ T细胞中，上述两种阳性细胞的比例均显著升高，且这种升高在多个时间点保持一致。在第29天接种E.G7-OVA肿瘤细胞后，αDEC205偶联的EVs治疗组小鼠的肿瘤生长速度减缓，生存期延长。在治疗性肿瘤模型中，小鼠在第1天接种E.G7-OVA细胞，随后在第10、12和14天分别皮下注射αDEC205偶联的EVs、单独的EVs、单独的αDEC205或PBS。与单独EVs、单独αDEC205或未治疗组相比，αDEC205偶联的EVs治疗组也显示出肿瘤生长减缓和生存期延长的趋势。此外，体外实验也证实，经αDEC205偶联的EVs预处理的BMDCs，能够激活OT-I细胞（表现为CD25、CD69上调，IFN-γ和TNF-α产生增加，以及增殖增强），并增强其对E.G7-OVA肿瘤细胞的杀伤能力。这些结果表明，通过代谢标记方法将αDEC205偶联到肿瘤EVs上，可以改善EVs内抗原向DCs的递送，增强DCs的激活状态，并整体提升肿瘤EV疫苗的抗原特异性CTL应答和抗肿瘤疗效。
为了进一步提高EV疫苗的抗肿瘤疗效，研究人员探索了将αDEC205与常用的Toll样受体9（TLR9）激动剂CpG共偶联到肿瘤EVs上的效果。合成了αDEC205/CpG偶联的EVs（αDEC205/CpG-EV）和仅CpG偶联的EVs（CpG-EV）。体外实验表明，两者均能激活DCs并呈递MHCI-SIINFEKL，但αDEC205/CpG-EV预处理的DCs更能促进OT-I细胞的长期增殖。体内实验显示，皮下注射αDEC205/CpG-EV和CpG-EV均能诱导产生SIINFEKL特异性CD8+ T细胞，且αDEC205/CpG-EV诱导的全身性SIINFEKL特异性CD8+ T细胞水平略高于CpG-EV。在预防性和治疗性肿瘤模型中，与之前描述的αDEC205-EV或未修饰的EV相比，αDEC205/CpG-EV和CpG-EV均显示出显著改善的肿瘤控制和动物生存。且与CpG-EV相比，αDEC205/CpG-EV进一步略微降低了肿瘤生长速度并延长了动物生存期。这些实验表明，CpG佐剂的共偶联可以进一步提升αDEC205偶联肿瘤EV疫苗的CTL应答和抗肿瘤疗效。
在讨论部分，研究人员指出，EVs因其在治疗和诊断方面的应用前景而备受关注。本工作基于前期开发的代谢标记技术，展示了通过点击化学将DBCO-αDEC205简便偶联到叠氮标记的EVs上的方法。表面αDEC205功能化赋予了EVs靶向DCs的能力，显著提高了DCs对EVs的摄取效率。与通常依赖氨基-羧基偶联或抗体结合表面蛋白的传统EV修饰方法相比，研究人员的代谢标记和偶联方法具有普适性，可应用于不同细胞来源的EVs。该方法克服了天然EVs上功能基团或特定蛋白质分子丰度低的问题，为开发增强型EV诊断和治疗平台提供了可能。
除了增强细胞摄取外，与对照组EVs相比，αDEC205偶联的EVs还能诱导DCs的激活，并改善DCs对EVs内抗原的处理和呈递。这赋予了其在预防性和治疗性设定中更强的CTL应答和适度改善的肿瘤控制能力。然而，单独的αDEC205功能化虽能增强EVs被DCs摄取和提高DCs的激活状态，但其效力不足以产生显著的治疗效益。因此，研究表明，αDEC205与CpG佐剂的共偶联可以进一步提升EV疫苗的CTL应答和治疗疗效。尽管CpG偶联的EVs已显示出引发良好CTL应答和抗肿瘤疗效的潜力，但CpG等佐剂的系统性毒性仍是其潜在临床转化的障碍。本研究引入的αDEC205共偶联策略，为通过使用更少的佐剂量来增强EV疫苗的CTL应答提供了一种可行选择。未来优化αDEC205/CpG偶联EVs中αDEC205与CpG的比例将具有重要价值。将EV疫苗与现有的免疫疗法（包括检查点阻断）相结合也值得进一步研究。
总结而言，研究人员报告了一种简便的方法来开发αDEC205偶联的肿瘤EVs，即通过代谢标记在EVs上引入叠氮基团，然后通过点击化学将DBCO-αDEC205偶联到叠氮标记的EVs上。研究表明，αDEC205偶联的肿瘤EVs能够优先被DCs而非其他类型的细胞摄取。与对照组EVs相比，αDEC205偶联的肿瘤EVs可以诱导DCs的激活并改善DCs对EVs内抗原的处理，从而引发增强的CTL应答。αDEC205与CpG佐剂的共偶联可以进一步提升肿瘤EV疫苗的CTL应答和抗肿瘤疗效。本研究为提升传统肿瘤EV疫苗的抗肿瘤疗效引入了一种简便方法，并提供了一个通用平台，用于在EVs上展示靶向配体，以实现EVs向目标细胞类型的靶向递送。
