《Journal of Extracellular Vesicles》：CD133 Shapes Extracellular Vesicle Cargo and Angiogenic Function in Basal-Like Triple-Negative Breast Cancer
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细胞外囊泡（EVs）是肿瘤-基质通讯的核心介质，然而调控其生物发生和功能性货物的机制仍知之甚少。本研究发现，CD133（Prominin-1）在基底样三阴性乳腺癌（BL-TNBC）细胞中选择性表达，作为EV生成和货物组成的关键组织者。CD133定位于质膜突起和
细胞外囊泡（EVs）是肿瘤-基质通讯的核心介质，然而调控其生物发生和功能性货物的机制仍知之甚少。本研究发现，CD133（Prominin-1）在基底样三阴性乳腺癌（BL-TNBC）细胞中选择性表达，作为EV生成和货物组成的关键组织者。CD133定位于质膜突起和脂筏，在此维持膜结构，促进EV释放，并指导选择性货物装载，包括促血管生成因子CD105（Endoglin）。在功能上，CD133+ EVs以CD105依赖性方式强力诱导内皮细胞成管，且不依赖于EV结合或内皮增殖的差异。在体内，这些EVs优先积累于肺和肝脏，凸显了器官特异性通讯。从机制上讲，CD133维持脂筏完整性，促进CD105选择性掺入囊泡，并建立一个空间协调的CD133-CD105轴。总之，研究人员的发现定义了一种亚型特异性的EV群体，其身份和血管生成活性由膜组织决定。通过将突起结构与囊泡介导的信号传导联系起来，这项研究突出了CD133富集的EVs作为侵袭性BL-TNBC的潜在生物标志物和治疗靶点。
本文解读
三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌（BC）中高度侵袭性的亚组，缺乏雌激素和孕激素受体表达以及HER2扩增。虽然TNBC仅占所有BC的15%–20%，但与早期复发、转移和不良预后显著相关。这主要归因于其有限的治疗选择和固有的分子异质性。转录组学分析已将TNBC划分为几个具有不同信号通路的分子亚型，包括基底样（BL1和BL2）、间充质（MES）和管腔雄激素受体（LAR），每个亚型表现出独特的生物学行为和治疗反应。BL亚型是最常见的，富集了与细胞周期控制、DNA损伤修复和干性相关的基因。这些特征可能影响治疗抵抗性及与肿瘤微环境（TME）的相互作用。鉴于TNBC的侵袭性及其对TME相互作用的依赖，细胞外囊泡（EVs）已成为肿瘤-基质通讯的核心介质，使癌细胞能够调节其环境并传播促肿瘤信号。EVs是膜封闭的颗粒，将蛋白质、脂质和核酸运输到受体细胞，影响局部和远处组织的细胞行为。肿瘤衍生的EVs促进侵袭、免疫逃逸、治疗抵抗性和转移前微环境（PMN）的建立。EVs具有异质性，包含功能上不同的亚群，其大小、来源和货物各不相同。这包括内体来源的外泌体、直接从质膜出芽的微囊泡，以及在微绒毛、丝状纤毛和纤毛等特化膜突起处产生的突起衍生EVs（PD-EVs）。尽管外泌体和微囊泡已被广泛表征，但PD-EVs仍鲜为人知。值得注意的是，研究人员在果蝇中的近期研究表明，微绒毛衍生的CD133+ EVs介导了 Hedgehog形态发生素的极化递送，为PD-EVs可以作为方向性细胞间通讯的指导性载体提供了直接证据。CD133（Prominin-1）是一种五跨膜跨膜蛋白，定位于与EV生物发生相关的膜突起和脂筏。最初被描述为多种肿瘤类型中的癌症干细胞（CSC）标志物，CD133也在健康的体细胞干细胞和祖细胞中表达，包括神经、造血和上皮谱系。在这些背景下，它有助于膜组织，并可能调节EV生物发生和货物掺入。因此，CD133可能在EV生物学中发挥超越癌症的更广泛作用，参与正常干细胞和祖细胞中的囊泡介导通讯。在人类癌症中，CD133表达与肿瘤起始能力、治疗抵抗性和不良预后相关。在乳腺癌中，表达差异很大，在某些细胞系中为1%–2%，在BL-TNBC细胞如MDA-MB-468中接近80%。这种变异性，结合其定位于质膜突起以及在果蝇中释放EVs的作用，提出了CD133在人类肿瘤中主动调节EV生成和货物装载的可能性。
本研究确立了CD133作为BL-TNBC中EV生物发生和功能的核心组织者。CRISPR-Cas9介导的CD133敲除结合蛋白质组学分析揭示，CD133调控选择性货物装载，包括促血管生成因子CD105的掺入。在敲除细胞中重新表达CD133（挽救）恢复了PD-EV的分泌和CD105的掺入，支持CD133在囊泡生产和选择性货物装载中的特定作用。CD133+ EVs以CD105依赖性方式强力刺激内皮成管，并优先分布到肺和肝脏，提示其在早期器官趋向性信号传导中的作用。相比之下，用CD133+或CD133缺失的EVs进行长期预处理均同样促进了转移定植和血管重塑。这些结果表明，CD133主要塑造早期EV介导通讯的特异性，而非维持晚期进展。总的来说，研究人员的结果揭示了一个赋予EVs促血管生成活性的CD133-CD105轴，将CD133从一个被动的CSC标志物重新定义为囊泡介导信号传导的活性调节者，对侵袭性BL-TNBC乳腺癌亚型的血管生成、转移和治疗靶向具有影响。
为开展研究，研究人员使用了几个主要的关键技术方法。首先，利用CRISPR/Cas9技术在MDA-MB-468细胞中构建CD133敲除（KO）模型，并通过慢病毒转导构建CD133-GFP挽救细胞系以及通过shRNA构建CD105敲低（KD）细胞系。其次，采用差速超速离心（dUC）和尺寸排阻色谱（SEC）法从细胞条件培养基中分离EVs，并通过纳米粒子跟踪分析（NTA）、纳米流式细胞术（nFCM）、蛋白质印迹（WB）、多重组分微珠流式细胞术（MACSPlex）和免疫电子显微镜（IEM）对其进行表征。第三，进行无标记定量蛋白质组学（LFQ-MS）分析以比较WT和CD133 KO细胞来源EVs的蛋白质组成。第四，利用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行成管实验评估EVs的促血管生成功能，并通过流式细胞术分析EVs与HUVECs的结合及对内皮增殖的影响。第五，在免疫缺陷裸鼠模型中进行EVs体内分布研究、血管通透性评估以及乳腺脂肪垫原位移植实验。研究样本包括公开数据集和来自Curie Institute的患者队列（Curie Cohort），以及多个TNBC细胞系（MDA-MB-468， MDA-MB-231， HCC70）。
研究结果部分，首先“CD133在基底样TNBC中富集并与不良预后相关”。研究人员通过分析公开数据集和Curie队列发现，CD133（由PROM1编码）mRNA水平在TNBC中显著高于激素受体阳性（HR+）和HER2+亚型。进一步转录组分析显示，在TNBC细胞系中，PROM1/CD133 mRNA表达选择性富集于BL1和BL2亚型，而在MES和LAR亚型中仅检测到背景水平。重要的是，高PROM1/CD133 mRNA表达与TNBC患者较短的无复发生存期相关。这确定了CD133作为具有预后价值的BL-TNBC标志物。
其次，“BL-TNBC细胞释放具有亚型特异性标记谱的CD133+ EVs，提示其为PD-EVs”。研究人员选择基于其PROM1/CD133 mRNA表达的三个TNBC细胞系：MDA-MB-468 (BL1)、HCC70 (BL2) 高表达，和MDA-MB-231 (MES) 低/不表达。BL-TNBC细胞（MDA-MB-468和HCC70）释放的EVs显著多于MES细胞系（MDA-MB-231）。免疫电子显微镜（IEM）和MACSPlex分析证实，来自BL-TNBC细胞的EVs富含CD133（约80%-82%），而来自MDA-MB-231的EVs则富含CD63。这表明BL-TNBC细胞释放一种独特的CD133+ EV群体，符合PD-EVs的特征。
第三，“CD133是MDA-MB-468细胞中高效EV分泌和膜组织所必需的”。利用CRISPR/Cas9构建CD133 KO MDA-MB-468细胞。透射电子显微镜（TEM）显示，KO细胞的质膜突起更短且不规则。nFCM定量显示，与WT和乱序对照细胞相比，CD133 KO细胞的EV释放减少约两倍。这些结果证明CD133功能上需要高效EV分泌，并通过维持有组织的突起和上皮样膜结构参与EV生物发生。
第四，“CD133调控MDA-MB-468细胞中CD133+ EVs的分子货物和信号潜力”。对WT和CD133 KO细胞来源的EVs进行无标记定量蛋白质组学分析。无监督层次聚类显示CD133缺失显著改变了EV组成。差异丰度分析证实，除CD133外，CD105（Endoglin，一种促血管生成的TGF-β共受体）在CD133+ EVs中选择性富集。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络突出了一个富含CD133的EVs中的PROM1-ENG（CD133-CD105）簇。这些数据表明CD133不仅驱动EV生物发生，还塑造其分子组成。
第五，“CD133+ EVs独立于EV结合或内皮增殖促进血管生成”。使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行成管实验，发现用来自WT细胞的CD133+ EVs处理显著增强了毛细血管样管的形成，其网络复杂性和分支长度增加，效果至少与血管内皮生长因子（VEGF）相当。用DiD标记的EVs进行的流式细胞术分析显示，CD133+和CD133 KO EVs与内皮细胞的结合动力学相似，且两者对内皮增殖的刺激作用也无显著差异。这表明CD133+ EVs的促血管生成活性不是由于EV内化或有丝分裂信号的差异，而是反映了CD133依赖性方式下生物活性货物的富集。
第六，“CD133+ EVs表现出器官特异性积累”。在免疫缺陷裸鼠中，原位注射乱序对照或CD133 KO细胞后，原位肿瘤生长和上皮分化无显著差异。然而，静脉注射近红外标记的EVs后，CD133+ EVs优先积累于肺（约50%）和肝（约35%），而CD133 KO EVs在这些部位的定位显著减少。用EVs进行多次预处理后，肺血管通透性在两组间无显著差异。这表明CD133塑造了EV的生物分布和功能活性，可能参与生态位启动，且独立于肿瘤细胞内在生长特性。
第七，“CD105在CD133+ EVs中富集”。蛋白质组学分析揭示CD105在CD133+ EVs中选择性富集。蛋白质印迹和MACSPlex分析证实，CD133 KO细胞来源EVs中CD133和CD105水平均显著降低。细胞表面生物素化实验显示，CD133 KO细胞质膜上CD105的丰度降低。共聚焦显微镜显示CD133和CD105在质膜上存在空间邻近性。去垢剂抗性膜（DRM）分馏显示，在WT细胞中，CD133、CD105和脂筏标志物共同富集于低密度组分。这些发现表明CD133对于CD105在质膜上的滞留和脂筏完整性至关重要。
第八，“来自CD133+细胞的富含CD105的EVs促进血管生成”。在WT细胞中敲低CD105（shCD105）后，其来源EVs的促血管生成活性显著减弱。这表明CD105是CD133+ EVs促血管生成效应所功能必需的。
第九，“CD133控制EV生成和CD105掺入”。在CD133 KO细胞中重新表达CD133-GFP（挽救实验）。nFCM和NTA显示，挽救细胞的EV分泌恢复至接近WT水平。蛋白质印迹和MACSPlex分析证实，挽救细胞来源EVs中CD133和CD105的水平得到恢复。这直接证明了CD133是PD-EV生成和选择性CD105掺入所必需且足够的。
最后，本文的讨论部分总结如下：研究人员的研究证明，CD133不仅仅是癌症干细胞的被动标志物，更是BL-TNBC中EV生物发生和货物选择的主动组织者。通过维持膜突起和脂筏组织，CD133调控着一个独特囊泡群体的分泌和分子组成。尽管CD133+ EVs大小在外泌体范围内，但多项证据支持其起源于质膜突起，符合PD-EVs的特征。机制上，CD133定位于质膜中胆固醇依赖的脂筏微区，它与CD9、flotillin等共富集。CD133敲除导致膜突起更少且更不稳定，EV分泌受损，并削弱了CD105在膜和脂筏相关池中的丰度，支持CD133通过组织突起相关的胆固醇依赖微区来协调货物选择和囊泡出芽的模型。重要的是，在KO细胞中重新表达CD133恢复了PD-EV分泌和选择性CD105掺入至WT水平，提供了直接因果证据。研究定义了一个功能性的CD133-CD105轴。CD105作为血管生成所必需的TGF-β共受体，在CD133+ EVs中选择性富集并共分离于筏组分中。功能实验表明，敲低CD105消除了这些EVs的促血管生成效应，而不影响其与内皮细胞的结合，证实货物组成而非递送效率决定功能。在功能上，CD133+ PD-EVs在三维内皮分支实验中表现出强大的促血管生成活性，而这种活性不依赖于对二维单层培养中HUVEC增殖的刺激，表明EV介导的信号传导具有背景依赖性。CD133+ PD-EVs优先积累于肺和肝脏的趋向性，暗示CD133可能有助于器官趋向性EV行为和PMN形成。蛋白质组学分析还揭示CD133+ EVs富集了与细胞周期调控、线粒体活性和凋亡相关的蛋白质，表明其在肿瘤存活和适应TME中具有额外作用。研究人员的发现也具有明确的转化意义，鉴于CD105在血管生成驱动的癌症中的临床探索，CD105在CD133+ EVs中的富集突显了靶向这一EV亚群进行治疗的潜力。
研究结论部分翻译如下：总之，本研究确定了BL-TNBC中一种基于膜的EV生物发生机制，由CD133协调。通过基因缺失和挽救实验，研究人员证明CD133调控CD133+ PD-EVs的产生并控制CD105的选择性掺入。研究人员定义了一个塑造具有促血管生成特性的亚型特异性EV亚群的身份和功能的CD133-CD105轴。通过将CD133从被动的CSC标志物重新定位为囊泡组成的主动组织者，研究人员的发现直接将膜结构与肿瘤-基质通讯联系起来，并为侵袭性BL-TNBC提供了机制见解和转化机会。
