《Journal of Extracellular Vesicles》：DAMP Laden Extracellular Vesicles From the Airways of Patients With Severe SARS-CoV-2 Respiratory Infection Compromise Inflammation and Cellular Metabolism
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高度促炎性单核吞噬细胞（MNPs）在应对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等感染时，会导致呼吸道及其他器官的组织损伤。细胞外囊泡（EVs）能够从代谢和表型上重编程靶细胞，提示其在2019冠状病毒病（COVID-19）病理过程中具有潜在作用。研
高度促炎性单核吞噬细胞（MNPs）在应对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等感染时，会导致呼吸道及其他器官的组织损伤。细胞外囊泡（EVs）能够从代谢和表型上重编程靶细胞，提示其在2019冠状病毒病（COVID-19）病理过程中具有潜在作用。研究人员假设EVs驱动了COVID-19的炎症变化，并对其内容物及对单核吞噬细胞的影响进行了研究。研究人员从接受机械通气的有、无重症COVID-19患者的匹配外周血和气道中分离出EVs和MNPs，并收集了健康志愿者的血液样本。通过流式细胞术、显微镜、转录组学、PCR、蛋白质组学、质谱分析和生物能量学分析进行了表征。研究发现，重症COVID-19患者气道中的EVs携带改变的货物，特别是微小RNA（miRNA）减少以及线粒体DNA（mtDNA）和三磷酸腺苷（ATP）富集，而这种差异在血液循环中并不存在。这些富含损伤相关分子模式（DAMP）的EVs损害了健康单核吞噬细胞的功能，抑制了细胞因子（如白细胞介素-6（IL-6）、干扰素-α2（IFNα2））的产生，并下调了单核细胞蛋白质组图谱中鉴定出的炎症程序，同时还破坏了氧化磷酸化（OXPHOS）——这些特征与重症疾病中的气道MNPs相吻合。COVID-19气道EVs与单核细胞的相互作用减弱，且这些EVs的磷脂酰胆碱/溶血磷脂酰胆碱含量发生改变。研究结果揭示了一种独特的EV货物，它能重编程免疫代谢，从而鉴定出SARS-CoV-2利用的一种新型免疫调节机制。
本研究为深入理解重症COVID-19的发病机制提供了重要见解，特别是聚焦于单核吞噬细胞的代谢和功能改变以及细胞外囊泡在介导气道炎症中的作用，揭示了一种新的病毒免疫调节策略。
重症COVID-19的特征是过度炎症反应，其基础是单核吞噬细胞的功能障碍。高度炎症性的血液单核吞噬细胞迁移至呼吸道，取代具有修复功能的局部单核吞噬细胞，导致肺部损伤，同时迁移至心脏、肾脏等组织，引发局部组织损伤和功能障碍。持续的细胞因子水平升高促进了炎症的自我放大，增加了血管通透性、血栓形成、器官衰竭乃至死亡。过度炎症的机制决定因素尚不清楚，但细胞内的事件，如提供能量和支持生物合成中间体产生的细胞代谢适应以及炎症小体活化，可能驱动了过度活化的单核吞噬细胞表型。免疫代谢调节在多种病毒感染中都会发生。细胞外囊泡已被证明是细胞间通信的关键介质，能够影响单核细胞代谢和效应功能。EVs携带异质性货物，包括大分子（蛋白质、脂质、酶）和遗传物质（信使RNA（mRNA）、miRNA，可能还包含脱氧核糖核酸（DNA）和线粒体DNA（mtDNA），后者仍存在争议）。EVs的细胞来源和生物发生机制会影响其货物组成，使得来自不同器官或细胞类型的EVs以独特的方式影响靶细胞。目前尚无关于SARS-CoV-2感染气道EVs的研究。鉴于严重SARS-CoV-2感染期间的循环EVs会促进炎症和其他重症COVID-19的特征（如凝血），呼吸道内的EVs很可能改变关键靶细胞（如单核吞噬细胞）的炎症和代谢状态。研究人员假设，EVs是驱动COVID-19特征性炎症变化的关键因素。为此，研究人员利用从接受机械通气的有、无重症COVID-19患者在常规胸部物理治疗期间采集的匹配动脉血和支气管抽吸物（BAF）样本，研究了循环和组织特异性炎症环境及单核吞噬细胞功能，同时确定了EVs在全身和局部气道炎症中的贡献。研究突显了与SARS-CoV-2感染相关的BAF来源EVs本身是受到干扰的，其表型和货物发生改变，这些改变与通过影响细胞代谢从而削弱单核吞噬细胞反应有关。在体外模型中显示的反应，通过离体研究的气道来源单核吞噬细胞的表型和功能特征得到了重现。综上所述，这项工作表明，与血液循环相比，EVs在呼吸道内具有独特的功能，是新近描述的病毒免疫调节策略的一部分，为治疗提供了新的靶点。
研究背景方面，重症COVID-19中的高炎症状态以单核吞噬细胞功能障碍为基础，这些细胞从循环迁移至气道并替代局部修复性细胞，导致肺损伤，同时引发多器官损伤。炎症的自我放大和代谢失调被认为是关键驱动因素，但具体机制，尤其是局部微环境中的作用，尚不清楚。EVs作为重要的细胞间通讯媒介，可能参与重编程免疫细胞功能，但其在严重呼吸道感染中，特别是直接从感染气道来源的EVs作用尚未明确。因此，研究人员旨在阐明气道来源EVs在SARS-CoV-2感染相关单核吞噬细胞功能障碍和代谢失调中的角色。
为开展研究，研究人员使用了从重症COVID-19患者与非COVID-19对照患者的匹配动脉血和支气管抽吸物（BAF）中分离的细胞和EVs，以及健康志愿者的血液样本。主要技术方法包括：通过流式细胞术分析免疫细胞表型和EVs表面标志物；利用Seahorse细胞能量代谢分析仪评估单核吞噬细胞的糖酵解和氧化磷酸化功能；采用尺寸排阻色谱法（SEC）分离小细胞外囊泡（sEVs），并通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（Cryo-EM）和蛋白质免疫印迹（Western Blot）进行表征；应用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）进行无标记蛋白质组学分析；使用NanoString nCounter系统分析sEVs中的miRNA谱；通过MALDI-TOF质谱检测sEVs膜脂质（磷脂酰胆碱/溶血磷脂酰胆碱，PC/LPC）组成；并利用ATP检测试剂盒和实时荧光定量PCR（qPCR）测定sEVs内的ATP和mtDNA水平。
研究结果部分，“血液和支气管抽吸物的细胞与分子组成随严重SARS-CoV-2感染而改变”一节指出，通过对患者血浆和BAF的多因子分析发现，COVID-19患者气道样本中CXCL10水平显著升高，而CXCL9和CXCL11水平降低。血浆中干扰素λ（IFNλ）显著升高。可溶性受体中，仅神经纤毛蛋白-1（NRP-1）在感染患者血浆中显著降低。流式细胞术显示，COVID-19患者血液中性粒细胞显著升高，而单核细胞、B细胞、T细胞和自然杀伤T（NKT）细胞显著减少。两组患者BAF的细胞组成无显著差异，但BAF富含免疫细胞。
“外周和气道单核吞噬细胞在SARS-CoV-2感染患者中代谢和表型受损”一节发现，重症COVID-19患者外周和气道来源的单核吞噬细胞代谢均受损，表现为糖酵解和氧化磷酸化水平下降。其细胞因子产生能力降低。分析显示，外周血单核细胞中代谢转运蛋白CD36（脂肪酸）和CD98（长链中性氨基酸）表达显著降低，趋化因子受体CCR2和CX3CR1表达也降低。气道巨噬细胞除CX3CR1降低外，激活标志物CD163和CD206表达也降低，提示其M2样功能丧失。
“支气管抽吸物来源细胞外囊泡在SARS-CoV-2患者中的差异来源”一节表明，BAF和血浆中均分离出具有双层膜结构的小细胞外囊泡（sEVs）。通过MACSPlex分析sEVs表面标志物发现，与对照组相比，COVID-19患者BAF来源sEVs的多种血小板、内皮、免疫和淋巴细胞标志物显著减少。在康复患者中，这些标志物在7天后恢复；而在死亡患者中则持续紊乱。对SARS-CoV-2感染肺上皮类器官转录组数据的再分析显示，多个EV生物发生关键蛋白（如TSG101, TALDO1, RAB35）表达上调。
“血浆来源细胞外囊泡影响单核吞噬细胞功能但不改变细胞代谢”一节显示，将健康志愿者单核细胞与COVID-19患者血浆sEVs共培养，可显著促进IL-8和IFNα2等细胞因子产生，呈现促炎效应。然而，这种共培养并未显著改变单核细胞的糖酵解或氧化磷酸化参数。
“支气管抽吸物来源细胞外囊泡改变蛋白质组并具有代谢和功能后果”一节发现，与血浆sEVs相反，COVID-19患者BAF来源sEVs与单核细胞共培养后，总体趋势是抑制细胞因子产生，其中IL-6和IFNα2的下降具有显著性。同时，这些sEVs损害了单核细胞上调氧化磷酸化、生物能量学范围和备用呼吸能力的能力。对单核细胞进行的蛋白质组学分析显示，有61个蛋白发生显著变化。通路分析揭示了多个上调的生物学过程，主要涉及负向调节，如髓系白细胞介导的免疫和TNF超家族细胞因子产生，这与观察到的细胞因子产生减少和代谢改变一致。
“重症COVID-19患者的支气管抽吸物细胞外囊泡被优先摄取的程度降低并携带显著不同的货物”一节表明，通过共聚焦显微镜和流式细胞术分析发现，COVID-19患者BAF来源sEVs与单核细胞的相互作用减弱。质谱分析显示，这些sEVs的PC/LPC比率高于对照组，提示其膜组成改变可能影响摄取。NanoString分析发现，BAF来源sEVs中miRNA谱普遍下调，而循环sEVs中部分miRNA下调。此外，COVID-19患者BAF来源sEVs内的ATP水平和mtDNA含量（通过MT-CO2和MT-CO3基因表达衡量）均显著高于对照组。
论文讨论部分总结，研究揭示了重症COVID-19气道中独特的sEV表型，其特点是膜组成改变（高PC/LPC比率）、miRNA全局性减少、DAMP（ATP和mtDNA）富集以及被靶细胞摄取减少。这种复合特征与循环sEVs的促炎作用不同，它协同地将单核细胞重编程为一种抑制细胞因子产生和减少氧化磷酸化的状态，这与重症COVID-19患者气道中观察到的单核吞噬细胞功能障碍在离体水平相吻合。这种表型可能代表了SARS-CoV-2利用的一种多重机制，旨在控制过度炎症，同时通过替代途径（如上调IL-8产生和NF-κB信号）持续招募白细胞并激活炎症，从而导致免疫抑制与慢性炎症并存的失调状态。研究还观察到，这种sEV表型与患者临床结局相关：康复患者其表型恢复，而死亡患者则持续紊乱。这突显了sEV介导的通讯和代谢重编程，特别是在气道局部，在重症COVID-19发病机制中的关键作用，为理解过度炎症的驱动机制和开发更有效的治疗策略提供了新视角。
