内生菌联合体诱导甘蔗抗黑穗病候选基因的转录组与代谢组学分析

《Plant Stress》：Transcriptomic and Metabolomic Profiling Reveal Candidate Resistance Genes in Sugarcane Induced by Endophyte Consortia Against Smut Disease

　　

甘蔗生产受到由甘蔗黑穗病菌（SS）引起的黑穗病的严重限制。本研究评估了两种细菌内生菌——芽孢杆菌属 QN2MO-1（BS）和绿针假单胞菌（PS）——单独及联合应用于两个甘蔗品种ROC22和中糖3号（ZT3）的生防潜力。研究人员进行了综合分析，包括基因型鉴定、胁迫损伤指标、植物激素水平、水解酶活性以及抗氧化酶响应，并进行了整合转录组学和代谢组学分析。结果表明，内生菌处理显著改善了植物生长、光合效率、抗氧化能力、水解酶活性以及胁迫响应防御通路的激活。整合组学分析鉴定了20个与黑穗病抗性相关的候选抗病基因和10种代谢物。其中，4个基因在内生菌处理的植物中下调，12个基因上调。此外，4个基因在内生菌处理后表现出一致的诱导表达，但在黑穗病感染下却下调。值得注意的是，参与乙烯信号传导（Sc05Bg379000）、茉莉酸途径（Sc05Dg189200和Sc05Bg331800）以及苯丙烷代谢（Sc07Eg089200和Sc05Ag165800）的调控基因被强烈诱导，促进了次生代谢物的生物合成。基于液相色谱-质谱联用（LC–MS）的代谢组学分析显示，绿针假单胞菌（PS）处理提高了木犀草素-7-葡萄糖苷、茉莉酸、亚麻酸、水杨酸甲酯和苯乙酸的水平，而芽孢杆菌属（BS）处理则增强了水杨酸β-D-葡萄糖苷、反式阿魏酸、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷、丁香酸和D-(+)-苹果酸。相比之下，黑穗病感染植物的代谢谱出现紊乱。联合内生菌处理导致与防御相关的代谢物产生了协同且稳定的积累。总体而言，这些发现表明内生菌联合体显著增强了甘蔗对S. scitamineum的抗性，突显了其作为通过生物技术手段和定向育种计划开发抗黑穗病品种的有效策略的潜力。

甘蔗是热带和亚热带地区广泛种植的重要经济作物，是糖、乙醇及其他副产品的主要来源。在中国，其糖产量占全国总产量的近90%。然而，甘蔗生产受到病虫害的严重影响，尤其是由S. scitamineum引起的黑穗病。该病原菌在广西、云南、广东和海南等主要产区构成主要限制因素，根据品种和当地条件不同，造成10%至75%的产量和品质损失。常规管理措施和化学杀菌剂因其高成本和环境风险而存在局限性。因此，亟需寻找有效且可持续的替代方案来防治植物病害。利用植物生长促进内生菌（PGPEB）的生物防治策略提供了一个有前景的解决方案。PGPEB是一组多样化的有益微生物，通过多种直接和间接机制（如产生抗菌化合物、争夺营养和生态位以及诱导寄主植物的系统性抗性）在抑制植物病原体、限制其增殖并减轻相关损害方面发挥着关键作用。许多研究已证实内生微生物在管理由细菌、病毒和真菌病原体引起的主要甘蔗病害方面的有效性。在有前景的生防菌剂中，假单胞菌属（Pseudomonas）和芽孢杆菌属（Bacillus）物种因其强大的拮抗活性和环境适应性而备受关注。绿针假单胞菌以产生具有抗真菌特性的次生代谢物而闻名，能抑制多种病原体；而芽孢杆菌属物种则通过诱导抗性反应、形成生物膜以及在恶劣环境条件下生存来贡献于植物保护。这两种细菌结合显示出作为协同生防联合体的潜力。虽然单一菌株接种在多变的田间条件下效果有限，但结合多种有益特性（如抗病性、促生性和环境适应性）的联合体方法可能提供更稳健和一致的结果。然而，此类联合体（尤其是在田间条件下的甘蔗中）的定殖行为和相互作用动态仍未得到充分探索。本研究旨在利用转录组学和代谢组学分析评估绿针假单胞菌和芽孢杆菌属 QN2MO-1对甘蔗生长和黑穗病抑制的协同效应。除了评估促生和抗病性外，这种整合组学方法将有助于鉴定参与甘蔗黑穗病或植物防御的关键黑穗病抗性基因及相关代谢途径。发现这些分子标记将有助于更好地理解植物-病原体-微生物相互作用，并支持通过分子育种或基因编辑策略开发抗性品种。最终，内生菌联合体的应用结合组学驱动的基因发现，有望增强甘蔗健康、提高产量稳定性并促进可持续农业实践。这种方法不仅减少了对农用化学品的依赖，还有助于甘蔗种植中长期的病害管理和环境管理。
研究人员采用的关键技术方法主要包括：1. **微生物菌株分离与培养**：从相关机构获取绿针假单胞菌（PS）和芽孢杆菌属 QN2MO-1（BS）菌株，并收集甘蔗黑穗病菌（SS）孢子进行培养。2. **田间试验设计**：在中国广东省甘蔗育种资源站开展随机完全区组设计（RCBD）的田间试验，测试了两个甘蔗品种（易感的ROC22和抗病的中糖3号），设置六个处理组（对照、单独病原菌感染、单独或联合内生菌处理及病原菌联合内生菌处理）。3. **整合多组学分析**：对甘蔗叶片样本进行**转录组分析**（使用Illumina NovaSeq平台进行RNA测序）和**非靶向代谢组学分析**（采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用，UHPLC-HRMS），以鉴定差异表达基因（DEGs）和差异表达代谢物（DEMs）。4. **生物信息学分析**：利用生物信息学工具对RNA-seq数据进行质控、比对、基因表达定量、差异表达分析、GO和KEGG通路富集分析；对代谢组学数据进行峰检测、对齐、代谢物鉴定和通路富集分析。5. **分子验证**：通过定量实时荧光PCR（qRT-PCR）技术验证转录组数据中关键基因的表达模式。
**3.1 拮抗活性、分子确认及内生菌与黑穗病菌的再分离**
体外抑制试验表明，芽孢杆菌属（BS）和绿针假单胞菌（PS）单独应用对S. scitamineum菌丝生长分别有29%和43.5%的抑制率，而两者联合应用（BS+PS）的抑制率显著提高至67.64%，显示出协同增效作用。通过PCR技术在接种15天后成功检测到内生菌和病原菌在甘蔗组织内的定殖，并通过再分离培养证实了这些微生物的存活和生物学特性。
**3.2 形态学特征分析**
田间形态学观测显示，联合内生菌处理（BS+PS）显著促进了两个甘蔗品种的营养生长，表现为株高、叶片数量、叶长、叶宽、茎径、根长和生物量等指标的提升。S. scitamineum感染则导致植株矮化、叶片发育不良等典型黑穗病症状，但内生菌处理（尤其是BS+PS+SS）能部分缓解这些抑制效应。抗病品种中糖3号（ZT3）在各项形态指标上普遍优于易感品种ROC22，显示出更强的抗病性和对内生菌处理的积极响应。
**3.3 生理响应**
生理指标测定表明，黑穗病感染（SS处理）显著降低了甘蔗的净光合速率（Pn）、光化学猝灭（qP）、PSII光化学效率（YII）、电子传递速率（ETR）和叶绿素含量，同时增加了胞间CO?浓度（Ci）和非光化学猝灭（NPQ）。内生菌处理（尤其是BS+PS联合处理）能有效逆转这些负面影响，显著提升光合参数和叶绿素含量，表明内生菌能增强甘蔗在病原菌胁迫下的光合效能和抗逆性。
**3.4 黑穗病发病率和严重度**
在田间条件下，未处理的黑穗病感染对照组发病率最高。单独使用内生菌处理（如BS+SS）能显著降低ROC22品种的发病率和严重度，而联合内生菌处理（BS+PS+SS）在两个品种中均未检测到黑穗病症状，表明内生菌联合体能有效抑制黑穗病的发展。抗病品种ZT3在所有处理中的发病率和严重度均低于易感品种ROC22。
**3.5 氧化应激标志物与抗氧化酶活性**
黑穗病感染导致甘蔗叶片中过氧化氢（H?O?）、丙二醛（MDA）以及抗氧化酶——过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性显著升高，表明病原菌侵染引发了强烈的氧化应激。内生菌处理（BS、PS或BS+PS）能不同程度地降低H?O?和MDA水平，并调节抗氧化酶活性，缓解氧化损伤。其中，抗病品种ZT3的抗氧化防御系统响应更为强烈。
**3.6 植物激素谱分析**
植物激素分析显示，黑穗病感染诱导了脱落酸（ABA）、乙烯（ETH）、赤霉素（GA?）和生长素（IAA）的积累，反映了胁迫信号传导。内生菌处理显著降低了这些胁迫相关激素的水平，同时上调了茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）的含量，表明内生菌能重塑激素平衡，激活系统获得性抗性（SAR）和诱导系统性抗性（ISR）等防御通路。
**3.7 水解酶活性**
内生菌处理显著提高了甘蔗叶片中蛋白酶、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶和脂肪酶的活性。这些水解酶能够降解真菌细胞壁成分（如几丁质、葡聚糖和蛋白质），直接抑制病原菌生长，是内生菌发挥生防作用的重要机制之一。
**3.8 转录组谱分析**
基因本体论（GO）富集分析显示，差异表达基因（DEGs）显著富集于激素信号传导、防御反应、细胞壁组织、光合作用和次生代谢等过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析突出显示了植物激素信号转导、植物-病原体相互作用和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是核心响应通路。内生菌处理主要诱导基因上调，而黑穗病感染则导致广泛的基因下调。
**3.9 代谢组学分析**
差异代谢物（DEMs）分析揭示了显著的代谢重编程。内生菌处理植物表现出广泛的代谢物上调，富集于苯丙烷和类黄酮生物合成、苯丙氨酸代谢、亚油酸代谢、类胡萝卜素生物合成以及激素信号传导等途径。代谢物谱显示，绿针假单胞菌（PS）处理主要增加了木犀草素-7-葡萄糖苷、茉莉酸等代谢物；芽孢杆菌属（BS）处理则增强了水杨酸β-D-葡萄糖苷、反式阿魏酸等。黑穗病感染植物的代谢谱以广泛下调为特征。
**3.10 整合转录组与代谢组分析及关键候选基因鉴定**
整合分析筛选出20个共同差异基因/代谢物，主要富集于植物激素信号转导、植物-病原体相互作用、MAPK信号和代谢过程。其中，关键调控基因包括：参与乙烯信号传导的Sc05Bg379000（属于EIN2/EIL家族）、参与茉莉酸生物合成的Sc05Dg189200和Sc05Bg331800（与JAZ调控相关），以及参与苯丙烷代谢的Sc07Eg089200和Sc05Ag165800。这些基因在内生菌处理下被强烈诱导，与防御相关次生代谢物（如反式阿魏酸）的积累正相关。蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析证实这些候选蛋白与玉米等模式植物的胁迫响应蛋白具有高度同源性，支持其在甘蔗抗黑穗病中的功能。
**3.11 qRT-PCR验证**
通过qRT-PCR对20个关键基因进行验证，其表达模式与转录组数据高度一致，证实了整合组学分析的可靠性。黑穗病感染下调的基因在内生菌处理下显著上调，进一步证实了内生菌在激活宿主防御反应中的作用。
**4. 讨论与结论**
讨论部分总结，内生菌联合体（BS+PS）通过多重机制增强甘蔗对黑穗病的抗性：1) 直接拮抗病原菌生长并促进其定殖；2) 改善植物生长、光合作用和抗氧化能力；3) 调控植物激素平衡，激活JA、SA和乙烯介导的防御信号通路；4) 诱导水解酶活性增强；5) 在转录水平上重编程防御相关基因表达网络，鉴定出Sc05Bg379000、Sc05Dg189200、Sc05Bg331800、Sc07Eg089200和Sc05Ag165800等关键候选基因；6) 在代谢水平上促进防御相关代谢物（如类黄酮、酚酸和植物激素）的协同稳定积累。这些发现表明，内生菌联合体能有效重编程甘蔗的生理、转录和代谢网络，从而增强其对黑穗病的系统性抗性。
研究结论部分指出：本研究表明，由S. scitamineum引起的甘蔗黑穗病严重限制生产，但细菌内生菌（芽孢杆菌属 QN2MO-1和绿针假单胞菌）能有效控制该病。在盆栽和田间条件下，这些细菌改善了植物生长、光合作用、抗氧化酶和水解酶活性，同时减少了氧化损伤。它们还增强了防御相关激素（SA和JA）并平衡了其他激素（ABA、乙烯、GA?、IAA），表明激活了系统性抗性。整合组学分析鉴定出20个与激素信号、MAPK通路、抗氧化防御和苯丙烷代谢相关的候选基因（Sc07Cg186000, Sc05Bg379000, Sc05Bg331800, Sc02Bg280100, Sc07Bg244500, Sc07Bg244600, Sc01Cg085600, Sc04Cg268400, Sc06Cg097700, Sc07Cg167700, Sc03Bg118400, Sc05Eg246300, Sc03Ag140600, Sc1os3g000300, Sc5_9Ag435500, Sc05Dg189200, Sc04Dg160000, Sc03Dg113800, Sc07Eg089200和Sc05Ag165800）。代谢组学谱分析显示，防御相关化合物（包括类黄酮、酚类和植物激素）显著积累，其中BS+PS联合体表现出最强和最稳定的代谢激活。总体而言，内生菌联合体重编程了生理、转录和代谢网络，增强了甘蔗对黑穗病的抗性，突显了其作为环保型生防菌剂和开发抗病品种宝贵资源的潜力。