受生物启发的铜基纳米酶，模拟漆酶的活性，用于持续去除抗生素药物污染物

《Separation and Purification Technology》：Bioinspired cu-based nanozyme mimicking laccase activity for continuous removal of antibiotic drug contaminants

　　

林倩晴|王云|季一冰|李瑞军

中国药科大学分析化学系，南京210009，中国。

摘要

模仿天然漆酶（Lac）的活性位点是克服其稳定性差和降低成本的关键策略。此外，寻找低能耗且合成快速的酶替代品仍然是一个长期挑战。本文报道了一种在室温下通过超声处理快速合成的高活性、高稳定性的漆酶模拟纳米酶（A/Cu纳米酶）。酶学表征研究表明，A/Cu纳米酶具有典型的酶催化特性。随后，将其装载到固定床连续流柱中，评估其处理四环素类抗生素污染物的能力。令人兴奋的是，该装置能够有效去除高浓度（500 mg/L）的污染物。溶液实验显示，一次过滤即可去除86.4%的四环素（TC）、88.1%的氧四环素（OTC）和氯四环素（CTC）。同时，20 mg/L的四环素在24小时内几乎被完全去除。本研究展示了一种制备类漆酶纳米酶的温和方法，并利用固定床连续流装置有效去除四环素类抗生素，为药物污染物的环境修复提供了一种新策略。

引言

四环素类抗生素（TCs）具有优异的抗菌效果和低成本，成为目前使用最广泛的抗生素之一。主要的TCs包括四环素（TC）、氧四环素（OTC）、氯四环素（CTC）等[1]。它们在环境中难以自然降解，导致地表水中的浓度为0.07–1.34 mg/L，土壤中的浓度为86.2–198.7 mg/kg，牲畜粪便中的浓度为4.0 mg/kg[2]、[3]。动物和人类无法完全吸收TCs，大量TCs通过排泄物进入生态系统。这不仅抑制了动植物的生长，还影响人类健康。例如，它会抑制微生物活性，促进细菌耐药性的产生，并带来生态风险[4]、[5]，同时还会引发关节疾病、内分泌疾病和癌症等人类疾病[6]、[7]。因此，开发有效的处理技术及材料以去除环境中的残留TCs污染物至关重要。

近年来，人们探索了多种去除和降解药物污染物的策略，包括吸附[8]、电催化氧化[9]、催化降解[10]、膜辅助分离[11]和酶介导的生物转化[12]。例如，已有报道指出三维电催化系统结合过氧单硫酸盐活化可有效降解氟喹诺酮类抗生素（如诺氟沙星），展示了电化学高级氧化过程在药物污染物修复中的潜力[9]。基于金属氧化物的纳米复合材料（如Sb?O?-CuO）也被开发用于有机污染物的催化降解，利用了过渡金属氧化物的氧化还原活性[13]。这些研究表明，吸附、催化氧化和电化学活化是减少水中有机污染物的有效途径。

酶介导的生物转化被认为是去除环境污染物的有前景的方法[14]、[15]。漆酶（Lac）作为一种绿色催化剂，可以催化多种酚类化合物的降解，从而有效分解水中的污染物[16]、[17]。为了提高Lac的稳定性和可重复使用性，研究人员开发了多种改进技术，如固定化[18]、化学修饰[19]和定向进化[20]。然而，这些方法可能导致酶的构象变化，从而使其失活，因此难以广泛应用。围绕天然Lac活性位点设计无机-有机杂化材料成为解决上述问题的主要策略。例如，林等人制备了两种基于环状三核单元的金属共价有机框架（命名为Cu?-TDH COF和Cu?-BDU COF），具有出色的类漆酶活性，可用于识别六种酚类污染物[21]。李等人制备了一种以2-氨基-1,3,4-噻唑为配体的类漆酶纳米酶（Cu-ATZ），该纳米酶表现出较高的Cu?比例和优异的四环素去除效率[22]。

自由催化剂在污染物去除过程中通常面临回收和二次污染的问题。最近，一些膜分离技术展示了在处理污染物方面的独特优势[23]、[24]、[25]、[26]。然而，需要避免频繁更换过滤装置，并实现连续去除以更有效地降解污染物。相比之下，固定床连续流技术具有制备方便、操作简单、显著减少更换过滤器时间等优点，同时能够实现连续去除[27]、[28]、[29]。受固定床连续流技术的启发，我们尝试将其与Lac替代品结合，以实现TCs的有效和连续去除。

本研究通过模仿Lac的活性位点，在室温下通过超声处理成功合成了一种具有出色类漆酶活性的纳米酶（A/Cu），其中Cu2?作为活性中心，2-氨基咪唑作为配体。天然Lac的结构包含四个铜活性位点，铜离子活性中心通过组氨酸的多个咪唑氮原子与Cu2?配位，形成底物催化氧化和电子转移的途径[30]。2-氨基咪唑含有丰富的吡啶和吡咯氮，能够高度模拟组氨酸的咪唑氮。它与Cu结合形成Cu-N键，从而模仿Lac的活性位点。同时，2-氨基咪唑的氨基可以与Cu2?反应，将其还原为Cu?，形成Cu2?/Cu?氧化还原对，从而提高A/Cu的催化性能。酶活性验证结果表明，A/Cu纳米酶具有良好的稳定性和酶学特性。将A/Cu纳米酶集成到固定床连续流柱中后，该装置在一次过滤过程中可去除86.4%的TC、88.1%的OTC和CTC（浓度为500 mg/L）。此外，20 mg/L的TC在24小时内几乎被完全去除。该装置展示了去除高浓度TCs和连续处理TC的优异能力（图1）。这项研究为低能耗合成天然酶替代品和修复药物污染引起的环境污染提供了良好示例。

章节片段

关于A/Cu纳米酶去除四环素的研究

A/Cu纳米酶是根据参考文献进行改性的[30]。简要来说，将241.6 mg的Cu(NO?)?·2H?O溶解在10 mL 25%甲醇溶液中，再将83.09 mg的2-氨基咪唑分散在10 mL甲醇溶液中。缓慢混合后，将混合物放入超声仪器中，在400 W的功率下超声处理2小时。反应液离心后，用甲醇洗涤沉淀物，最终获得A/Cu纳米酶。

A/Cu纳米酶的表征

通过SEM观察了A/Cu纳米酶的形态（图2a）。A/Cu纳米酶具有不规则的块状结构。EDS元素分析确认Cu、C、N和O元素在A/Cu纳米酶中均匀分布（图2b）。A/Cu纳米酶的粒径分布为146.2 ± 36.0 nm（图S1）。

从A/Cu纳米酶的TEM光谱中可以清晰看到晶格条纹，其晶格间距为0.251 nm（图3a）。

结论

总之，受天然Lac活性位点的启发，我们在室温下通过超声处理成功制备了一种类漆酶纳米酶（A/Cu）。与天然Lac相比，A/Cu纳米酶在极端条件下表现出更好的活性和稳定性，以及对底物的更高亲和力。为了实现重复使用和连续处理，将A/Cu纳米酶装载到固定床柱中，并评估了其去除高浓度TCs的能力。

CRediT作者贡献声明

林倩晴：数据整理、形式分析、资金获取、研究、方法学、软件、验证、可视化、撰写初稿。王云：概念构思、形式分析、资金获取、方法学、研究、软件、撰写初稿。季一冰：监督、资源提供、撰写与编辑。李瑞军：项目管理、资源提供、监督、撰写与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：21804141和21904052）的支持。