由基因变异引起的疾病对人类健康构成重大挑战。单核苷酸变异（SNV）是指特定DNA位置上的单个核苷酸变化，是最常见的基因变异形式[1]。大量研究表明，SNV与多种病理状况相关，包括遗传疾病、癌症进展和传染病的易感性[2, 3]。例如，KRAS基因第12位密码子处的SNV在多种癌症中很常见，占胰腺癌（PC）突变病例的88.8%[4]。因此，检测与癌症相关的SNV为早期癌症筛查提供了有希望的途径。此外，某些SNV在预后和治疗中起着关键作用。例如，耐药性FLT3基因的D835Y/H/V突变对急性髓系白血病（AML）患者具有重要的治疗价值[5]。在慢性胰腺炎（一种复杂的遗传疾病模型）中，检测致病热点突变SPINK1 c.194+2T>C具有重要的诊断、预后和治疗意义。在特发性慢性胰腺炎（ICP）患者中，携带纯合突变个体的风险比携带杂合突变个体高5倍，且纯合突变携带者的发病中位年龄比杂合子早约10年[6]。携带SPINK1 c.194+2T>C突变的患者与没有突变的患者相比，胰腺癌风险不同[7]。此外，检测这种突变有助于识别潜在的基因治疗候选者[8]。因此，SNV检测技术的发展对于提高临床诊断和治疗水平以及促进预防医学的发展具有重要意义。
目前，SNV检测在各种医疗应用中受到了更多关注。在基于社区的疾病筛查项目中，迫切需要快速便捷的即时诊断方法，以便及时识别具有特定SNV相关疾病风险的个体。这有助于及时干预和跟踪疾病进展。此外，在急诊科或重症监护室等临床环境中，医生需要快速的SNV基因分型结果以做出即时治疗决策。这种时间敏感的情况突显了基于即时诊断的SNV检测的重要性。尽管临床需求迫切，但目前主流的SNV检测方法（如Sanger测序（FGS）、下一代测序（NGS）、实时定量聚合酶链反应（qPCR）、扩增抗性突变系统PCR（ARMS-PCR）和液滴数字PCR（ddPCR）仍存在显著局限性。这些方法的主要共同挑战包括高成本和复杂的工作流程[9]。此外，FGS的检测限（LOD）相对较高，约为10%，限制了其识别低丰度突变的能力[10]。NGS的周转时间较长（约10天），无法满足及时的临床决策需求[11]。虽然qPCR、ARMS-PCR和ddPCR可以提供快速结果（2～4小时），但它们仍然依赖于昂贵的设备和复杂的操作流程[12, 13, 14]。在这种背景下，开发一种灵敏、快速、成本效益高且用户友好的SNV检测平台对于满足更多场景的需求至关重要。
十年来，革命性的CRISPR/Cas（规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关）系统为SNV检测带来了新的思路。它依赖于RNA引导的效应器（包括Cas13a～d的RNase和Cas12a～f的DNase）以及编程引导RNA（gRNA）的协同作用。当识别到目标序列时，Cas酶被激活，导致单链（ss）DNA或ssRNA探针的非特异性切割，从而产生可检测的信号[15, 16, 17]。鉴于Cas酶对其目标的解离常数处于皮摩尔级别，将CRISPR与核酸扩增技术（如HOLMES低成本多功能高效系统、DNA内切酶靶向CRISPR报告系统（DETECTR）和特定高灵敏度酶报告系统unLOCKing（SHERLOCK））结合使用，已成为实现灵敏检测的最佳策略[18, 19, 20, 21]。最近的进展进一步推动了该领域的发展，包括用于多重检测的微流控空间编码[22, 23, 24]、用于增强信号输出的高阶核酸探针[25]以及用于单核苷酸变异区分的系统策略[26]。尽管取得了这些成就，大多数现有的基于CRISPR的检测方法仍需要多步骤的液体处理，因为核酸扩增和CRISPR/Cas切割反应不兼容[27, 28]。一些研究报道了单管CRISPR方法，这些方法利用光控或温度调节机制来调节Cas酶活性，从而简化了操作流程[29, 30, 31]。然而，这些依赖外部物理控制的方法需要专门的设备和熟练的操作人员，从而限制了其在资源有限环境中的应用。此外，一些研究人员开发了无需复杂仪器和培训操作人员的单管CRISPR方法[32, 33, 34, 35]。然而，大多数方法需要较长的孵育时间，且无法区分单碱基突变。因此，迫切需要开发一种创新的单管CRISPR检测策略，能够在单管内30分钟内完成快速检测，操作简便，无需复杂仪器，并具有高特异性的SNV识别能力。
在这里，我们介绍了STAR-CRISPR（通过RPA-CRISPR实现单管加速SNV识别），这是一种新型的一步法策略，能够超特异性和快速地检测人类基因组SNV。该方法将等温扩增与CRISPR/Cas12b系统集成在一个反应体系中，可在20分钟内完成检测。为了评估其临床适用性，我们将该方法应用于ICP、胰腺癌和白血病患者的临床样本中检测SNV。此外，为了更方便即时诊断，我们设计了便携式微流控芯片，具有集成的并行检测腔室，以实现SNV检测和野生型、纯合型和杂合型变异的同步可视化基因分型。这种设计允许通过肉眼观察直观地解释SNV状态，无需专用仪器。STAR-CRISPR平台以其快速反应动力学、单核苷酸区分精度和用户友好的格式，解决了即时诊断中的关键未满足需求。
