**EV-A71诱导消皮素E依赖的T细胞焦亡：新机制与甲钴胺治疗潜力**

《Virologica Sinica》：EV-A71 induces GSDME-dependent T-cell pyroptosis: A novel mechanism and MeCbl therapeutic potential

　　

肠道病毒A71（EV-A71）是导致幼儿重症手足口病（HFMD）的主要病原体，其重症临床结局与T细胞免疫功能障碍密切相关。然而，EV-A71介导T细胞损伤的分子机制尚不清楚，且目前缺乏特异性治疗方法。本研究探讨了EV-A71与T细胞之间的相互作用，并探索了潜在的靶向治疗策略。研究结果表明，EV-A71以剂量和时间依赖性方式有效感染T细胞系（Jurkat、EL-4）和原代小鼠CD3⁺ T细胞，诱导T细胞死亡并上调促炎细胞因子（白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α））。从机制上讲，EV-A71感染通过激活半胱天冬酶-3（caspase-3），而非半胱天冬酶-1（caspase-1），触发了T细胞中消皮素E（GSDME）依赖性的焦亡，而非消皮素D（GSDMD）依赖性焦亡，这得到了基因敲除和抑制剂实验的证实。甲钴胺（MeCbl），一种特异性GSDME抑制剂，挽救了EV-A71诱导的T细胞丢失，并显著提高了EV-A71感染新生小鼠的存活率（80%）。此外，MeCbl与AGS-A（一种T细胞依赖性治疗药物）联合治疗产生了协同保护效应，在野生型小鼠中达到了90%的存活率，这种效应在T细胞缺陷的BALB/c-nu-/-小鼠中被消除。总之，本研究发现GSDME依赖的T细胞焦亡是EV-A71感染的关键致病机制，并强调了MeCbl作为一种有前景的靶向药物，无论是单独使用还是与AGS-A联合使用，都可用于治疗HFMD。

本研究的背景在于肠道病毒A71（EV-A71）是导致全球幼儿重症手足口病（HFMD）的主要病原体，可引发严重神经系统并发症甚至死亡，但目前尚无特异性抗病毒药物或有效疗法。临床和既往研究表明，细胞免疫功能受损与EV-A71感染的重症表现密切相关，尤其是T细胞功能障碍，但EV-A71如何直接破坏T细胞免疫应答的具体分子机制长期不明，阻碍了有效治疗策略的开发。为此，研究人员开展了本项研究，旨在阐明EV-A71与T细胞相互作用的机制并寻找潜在治疗靶点。研究发现，EV-A71可直接感染T细胞，通过激活caspase-3并切割GSDME诱导GSDME依赖的细胞焦亡，导致T细胞丢失和免疫功能障碍。靶向抑制GSDME，例如使用甲钴胺（MeCbl），能够拯救T细胞免疫功能，对EV-A71感染展现出显著的体内治疗效果，无论是单独使用还是与AGS-A联合使用。这些发现不仅揭示了EV-A71致病的新机制，也为HFMD的治疗提供了新的潜在策略。该研究成果发表于《病毒学报》（*Virologica Sinica*）。

为开展此研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：使用人T细胞系Jurkat、小鼠T细胞系EL-4以及从野生型C57BL/6小鼠脾脏分离的原代CD3⁺ T细胞进行EV-A71感染实验。建立EV-A71感染的新生ICR小鼠及BALB/c小鼠模型，并使用BALB/c-nu-/-（裸鼠）作为T细胞缺陷模型。通过腹腔注射给予甲钴胺（MeCbl）和/或AGS-A进行治疗干预。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测病毒RNA载量及炎症因子mRNA水平。利用蛋白质印迹法（Western blot）分析焦亡相关蛋白（caspase-1/3， GSDMD， GSDME）的剪切活化情况。通过流式细胞术分析小鼠脾脏中CD3⁺ T细胞比例。使用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞死亡。所有动物实验均遵循相关伦理规范。

**EV-A71高效感染T细胞并诱导其死亡和炎症激活**
为验证EV-A71是否直接感染T淋巴细胞，研究人员使用Jurkat和EL-4细胞系，以不同感染复数（MOI）接种EV-A71。通过qRT-PCR检测感染后24小时的病毒RNA累积量，结果显示这两种T细胞系均能支持EV-A71感染。在MOI为1的情况下，对感染后12、24、36小时的病毒RNA水平进行动态监测，证实EV-A71不仅能在T细胞系中感染，还能有效复制。感染还导致Jurkat和EL-4细胞发生死亡，这通过检测胞质酶乳酸脱氢酶（LDH）的释放得到证实。此外，EV-A71感染显著刺激了Jurkat和EL-4细胞中促炎基因（包括IL-1β、IL-6和TNF-α）的mRNA水平。研究人员进一步在C57BL/6小鼠的CD3 T细胞中检测了EV-A71的感染与复制，获得了与T细胞系相似的数据：EV-A71以剂量和时间依赖性方式感染CD3 T细胞，并诱导LDH释放和促炎基因上调。这些结果共同表明，EV-A71能高效感染T细胞，诱导细胞死亡并触发炎症激活。

**EV-A71感染诱导依赖于GSDME的T细胞焦亡**
焦亡是一种典型的炎性细胞死亡形式。鉴于EV-A71感染诱导的T细胞死亡伴随炎症激活，研究人员推测其可能诱导了焦亡。为验证，他们在感染EV-A71的Jurkat细胞中检测了caspase-1和GSDMD的剪切（GSDMD依赖性焦亡标志），以及caspase-3和GSDME的剪切（GSDME依赖性焦亡标志）。Western blot分析显示，EV-A71感染不诱导caspase-1或GSDMD的剪切，也未观察到GSDME的剪切，但能触发caspase-3的剪切。进一步分析发现，Jurkat细胞中GSDME的基础表达量较低。当在Jurkat细胞中过表达GSDME后，EV-A71感染可观察到GSDME的剪切。因此，这些发现表明EV-A71感染在Jurkat细胞中诱导了GSDME依赖性焦亡。研究人员进一步在C57BL/6小鼠的CD3 T细胞中检测了EV-A71诱导的焦亡。结果显示，EV-A71感染同样不诱导caspase-1或GSDMD的剪切，但观察到GSDME和caspase-3的剪切。此外，通过构建稳定敲低GSDMD或GSDME的Jurkat细胞系发现，敲低GSDME（而非GSDMD）可显著减轻EV-A71感染或LPS加尼日利亚菌素处理诱导的细胞死亡（LDH释放）。使用caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK处理，可阻断EV-A71感染的Jurkat和CD3 T细胞中caspase-3和GSDME的剪切。综合发现揭示了EV-A71在T细胞中诱导GSDME依赖性的焦亡性细胞死亡。

**甲钴胺（MeCbl）治疗保护小鼠免受致死性EV-A71感染**
研究人员进一步评估了EV-A71诱导的T细胞焦亡在体内的生理相关性。MeCbl作为一种特异性GSDME抑制剂，已被报道能显著抑制GSDME依赖性焦亡。为确定MeCbl治疗EV-A71感染小鼠的作用是否与T细胞免疫反应相关，研究人员在EV-A71攻击24小时后，通过腹腔注射给予5日龄ICR小鼠MeCbl（10 mg/kg），随后每隔一天给药一次，共三次。数据显示，MeCbl治疗并未增加未感染小鼠脾脏中CD3⁺总T细胞的百分比，但能有效恢复EV-A71感染小鼠的T细胞比例至未感染水平。为评估MeCbl对EV-A71感染的治疗潜力，采用相同给药方案。结果显示，对照组小鼠从感染后第8天开始死亡，至第11天死亡率达60%。相比之下，MeCbl治疗组80%的小鼠存活下来。一致地，治疗组与对照组在体重变化和临床评分上存在显著差异。此外，在感染后第5天和第7天，MeCbl治疗组小鼠肌肉、脾脏和脑组织中的EV-A71病毒RNA累积量较对照组显著降低。值得注意的是，MeCbl在Jurkat细胞中未能抑制EV-A71复制，排除了其直接靶向病毒生命周期的可能性。这些结果表明，在病毒感染背景下，MeCbl治疗不仅能恢复T细胞的免疫反应，还在新生小鼠体内对EV-A71感染具有强大的治疗效果。

**MeCbl与AGS-A联合治疗在EV-A71感染小鼠中产生依赖T细胞的协同保护效应**
在之前的研究中，AGS-A的治疗效果依赖于T细胞的存在。研究人员接下来评估了MeCbl与AGS-A联合治疗在EV-A71感染小鼠中是否产生协同保护效应。在野生型BALB/c小鼠模型中，联合治疗组达到了90%的存活率，而MeCbl单药治疗组为60%，对照组死亡率为80%。联合治疗组在体重恢复和临床评分改善方面也表现出最佳效果。为评估这种协同效应是否依赖于T细胞的存在，研究人员利用缺乏T细胞的BALB/c-nu-/-小鼠进行实验。结果显示，在10日龄BALB/c-nu-/-小鼠中，与未治疗的EV-A71感染组相比，MeCbl与AGS-A联合治疗在存活率、体重和临床评分方面均未显示出任何协同保护效应。这些结果表明，MeCbl与AGS-A联合治疗的协同效应依赖于T细胞的存在。