《Current Research in Food Science》：Alcalase hydrolysis modulates the techno-functional properties of dry-fractionated pea protein, reduces the off-flavor compounds and refines the aroma profile
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干法分离（Dry fractionation）被公认为最具可持续性的蛋白质提取方法之一，但干法分离获得的蛋白质常表现出技术功能多样性有限，以及生豆类特有的不佳感官特征。本研究评估了不同处理时间（15, 97.5, 140, 180?min）和温度（50-60?
干法分离（Dry fractionation）被公认为最具可持续性的蛋白质提取方法之一，但干法分离获得的蛋白质常表现出技术功能多样性有限，以及生豆类特有的不佳感官特征。本研究评估了不同处理时间（15, 97.5, 140, 180?min）和温度（50-60?°C）下，使用碱性蛋白酶（Alcalase）对干法分离豌豆蛋白进行水解，以评估其对蛋白质结构、技术功能特性、挥发性化合物（Volatile Organic Compounds, VOCs）和气味活性化合物的影响。水解显著提高了水解度（Degree of Hydrolysis, DH）（在60?°C下处理180?min后高达约48%）和总游离氨基酸（Total Free Amino Acids, TFAA）含量，导致形成更小、极性更强的肽段，荧光光谱分析亦证实了这一点。结构变化直接影响了技术功能特性。事实上，水解后的样品表现出比未水解蛋白质更高的水溶性（Water Solubility Index, WSI）和更低的粘度，表明其分散性能得到改善。相反，由于形成低分子量肽段，过度水解对起泡能力（Foaming Ability, FA）和泡沫稳定性（Foaming Stability, FS）产生了负面影响。与青草味和豆腥味相关的标志性挥发性化合物，包括己醛（hexanal）、2-庚酮（2-heptanone）、1-己醇（1-hexanol）和1-戊烯-3-醇（1-penten-3-ol）显著减少。气相色谱-质谱-嗅闻（GC-MS-O）分析鉴定出22种气味活性化合物。大多数不受欢迎的气味活性化合物在水解后减少，而那些贡献更愉悦气味的化合物则基本不受影响。总体而言，碱性蛋白酶水解调控了干法分离豌豆蛋白的技术功能特性并优化了其香气特征。这些发现支持了使用酶解技术来扩大干法分离豆类蛋白在食品配方中的应用，同时缓解其感官局限性。
干法分离（Dry fractionation）作为一种不使用化学溶剂或水来浓缩植物蛋白的物理技术，因其能耗显著低于传统湿法提取过程，在蛋白质转型的背景下备受关注。从技术功能角度看，干法分离倾向于保留蛋白质的天然结构，与湿法提取的蛋白分离物相比，具有更好的界面性能和凝胶能力。此外，干法分离的配料包含蛋白质、碳水化合物、脂质、纤维和矿物质等多种成分，可能对产品配方有积极贡献。干法分离的另一个优势是设备可轻松适应多种豆类物种而无需特别调整。尽管有这些优点，干法分离固有的特性限制了加工条件的调控范围，因此干法分离配料往往表现出更窄的技术功能特性谱，从而比湿法提取的蛋白质多功能性更低。相比之下，湿法提取工艺可通过调整pH值、离子强度和温度等参数，并进一步辅以酶处理进行调节。这允许调控蛋白质纯度，从而拓宽配料的技术功能特性范围。此外，洗涤步骤有助于减少负责不良气味（即草味、青味和豆味）的挥发性化合物，而这些化合物在干法分离蛋白中得以保留，可能导致消费者接受度不佳。因此，这些缺点限制了干法分离配料在食品开发中的工业化应用。此外，干法分离的蛋白配料常常难以模仿和复制更传统且广泛使用的动物基蛋白配料的技术功能特性。为了克服这些缺点，研究人员提出了不同的策略，包括物理和生物技术处理。其中，酶水解被认为是改善植物基蛋白质技术和感官特性的策略之一。酶水解的优势在于其高特异性、易于加工控制和副产物生成最少。该技术利用蛋白水解酶选择性断裂肽键并调节水解产物的特性。必须控制的加工条件包括酶的类型、温度、pH值和处理时间。最终的水解度是监测水解过程的关键参数，因为它与所得配料的技术功能特性直接相关。多种食品级蛋白酶可用于酶水解。其中，碱性蛋白酶（Alcalase）是一种内切蛋白酶，已针对通过分离和湿法提取工艺获得的蛋白配料进行了广泛研究。该酶具有广泛的特异性，并且与其他蛋白酶相比能够达到更高的水解度，使其适用于不同的处理和应用。先前的研究强调了酶水解如何显著影响豆类蛋白水解物的技术功能和感官特性。例如，研究人员报道了对鹰嘴豆蛋白浓缩物和分离物进行碱性蛋白酶水解后溶解度增加。类似地，观察到使用碱性蛋白酶对豌豆蛋白分离物进行酶水解后溶解度提高，且起泡和乳化性能也随之提升，其变化取决于达到的水解度。也有研究调查了使用包括碱性蛋白酶在内的不同酶进行酶解对豌豆蛋白分离物技术和感官特性的影响，结果显示技术功能特性有所改善，但也观察到水解度依赖的苦味增加。最后，有研究评估了受控酶水解对大豆蛋白分离物的影响，观察到通常负责豆类不良风味的醛类显著减少。然而，如前所述，酶水解主要针对通过湿法提取获得的豆类蛋白分离物进行研究，而干法分离的蛋白配料在很大程度上尚未探索，这构成了一个重要的研究空白。此外，水解对挥发性化合物浓度及其对气味表征贡献的影响仍未知。基于上述前提，研究人员提出，使用碱性蛋白酶进行酶水解可用于干法分离的蛋白质，以实现：i）调节其技术功能特性，旨在扩大可能的应用范围；ii）改善其香气特征，减少负责不良豆类风味的气味活性化合物。为实现这些目标，仔细评估加工参数的影响对于实现对水解的精确控制并为特定食品应用定制配料至关重要。因此，本研究考察了不同加工条件下，使用碱性蛋白酶对干法分离的黄色豌豆蛋白进行酶水解，评估了其对蛋白质结构、技术功能特性、挥发性特征和气味活性化合物的影响，同时为所得蛋白水解物的技术应用提供了指导。
本研究利用实验设计（Design of Experiments, DoE）方法，考察了相关工艺变量（温度、水解时间和酶的有无）的影响。具体采用D-最优设计，评估了两个温度（50?°C和60?°C）在四个取样时间点（15, 97.5, 140, 180?min）以及酶存在/不存在（编码为1和0）的效应。酶的存在/不存在变量作为对照被纳入，以评估内源酶或处理过程中50-60?°C热效应可能带来的任何影响。总共进行了16次实验，并带有8次重复以估计失拟和设计误差。整个设计在两次不同的水解实验中重复进行。响应值根据两因素交互模型进行建模。黄色豌豆干法分离蛋白与超纯水（30% w/v）制备的悬浮液，用NaOH调节pH至8.0（酶的最佳pH值），并在4?°C过夜水化。对于含酶试验，按蛋白质含量的2%（w/v）添加碱性蛋白酶。混合物在恒温水浴中加热至实验设计计划的温度，在持续搅拌下进行水解。在预定时间点取样，并通过95?°C水浴20?min使酶失活。样品随后冷冻、冻干、研磨、过筛（??=?1?mm）并储存。水解度（DH）按照文献方法计算。总游离氨基酸（TFAA）采用茚三酮比色法测定。肽谱通过反相快速蛋白液相色谱（RP-FPLC）分析。蛋白质悬浮液的内源荧光激发-发射矩阵（EEMs）通过平行因子分析（Parallel Factor Analysis, PARAFAC）进行建模。抗营养因子如植酸和棉子糖分别使用检测试剂盒进行定量。技术功能特性包括水吸收指数（Water Absorption Index, WAI）、水溶性指数（WSI）、粘度、起泡能力（FA）和泡沫稳定性（FS20）。挥发性有机化合物（VOCs）分析采用固相微萃取-气相色谱-质谱（SPME-GC-MS）进行。气味活性化合物通过固相微萃取-气相色谱-质谱-嗅闻（SPME-GC-MS-O）进行分析。数据通过Design-Expert和OriginPro软件进行统计分析和可视化。
研究结果表明，模型对所有响应均显著（p?≤?0.05），且具有高R2和调整后R2值，证实实验设计充分描述了研究范围内系统的变异性。在考虑的加工条件中，酶的存在/不存在（C）对大多数响应具有最强且最显著的整体影响。这符合预期，因为酶的添加旨在调控蛋白配料的特性。水解积极影响了所有与蛋白水解相关的指标，如DH、TFAA和肽谱。相反，所选挥发性化合物的负系数表明酶处理也影响了配料的挥发性特征。除酶效应外，温度（A）和时间（B）对某些响应显著。然而，系数大小表明时间对所研究响应的影响最强。此外，发现了显著的相互作用，尤其是酶和时间之间，表明各因素的效应并非简单相加，水解动力学依赖于酶的存在和反应持续时间的共同作用。对棉子糖和植酸的统计学显著性有限，表明所选水解条件对这些抗营养因子的影响可忽略不计。
在蛋白水解、游离氨基酸、肽谱和内源荧光方面：未加酶样品的这些指标在180?min内几乎恒定，表明内源酶的水解活性可忽略。水解处理时间是仅次于酶存在/不存在的第二大影响因素。整体上，即使水解15?min也能观察到高DH，温度也显著影响DH，60?°C下获得最高值。DH的增加与TFAA的增加直接相关。RP-FPLC分析表明，水解样品显示峰向早期洗脱转移，表明形成了更小、更亲水的肽段。荧光分析显示，酶的存在是驱动可检测结构变化的主要因素，水解样品的PARAFAC得分增加，表明芳香族氨基酸残基暴露增加。
在技术功能特性方面：水解显著提高了WSI（从约35%提高到50%以上），同时降低了WAI和粘度。WSI受水解时间显著正向影响，且时间与温度存在显著相互作用。粘度因水解而显著降低，较低粘度可归因于蛋白质溶解度增加和形成低分子量肽段。起泡能力（FA）受温度和时间的负面影响，但受酶存在的显著正向影响。水解导致泡沫稳定性（FS20）恶化。因此，碱性蛋白酶水解调控了干法分离蛋白的技术功能特性，使其更适合饮料或液体应用，但不太适用于需要高吸水性、稳定泡沫或其他界面性能的应用。
在挥发性特征方面：Alcalase水解显著降低了选定的标志性化合物（己醛、2-庚酮、1-己醇和1-戊烯-3-醇）的浓度。己醛的减少可能与热灭活脂肪氧化酶（LOX）和水解过程中蛋白质构象变化暴露的结合位点有关。GC-MS-O分析鉴定出22种气味活性化合物。其中8种具有豆腥和青草味。水解样品中大多数气味活性化合物的浓度和气味强度显著降低，包括己醛、2-乙基-1-己醇、1,3-二-叔丁基苯、十一烷和2-戊基呋喃。值得注意的是，2-戊基呋喃在水解样品中不再被感知。相反，其他与愉悦气味相关的化合物（如2-乙酰基吡啶、2-乙酰基噻唑、苯甲醛等）的浓度变化但其嗅觉感知不受水解影响。整体上，正面芳香属性在处理过程中得以保留。
研究人员提出了关于香气轮廓调控的主要假设：1) 热处理（尤其在60?°C）可能部分灭活了参与脂质氧化途径的内源酶（如LOX和氢过氧化物裂解酶）；2) 碱性蛋白酶水解改变蛋白质构象，暴露先前埋藏的疏水和芳香基团，这些基团可通过相互作用结合挥发性分子，降低其挥发性；3) 水解过程可能通过释放新前体物质，改变挥发性物质的生成途径。这些机制共同作用，解释了香气轮廓的观察变化。
论文结论指出：碱性蛋白酶水解有效调控了干法分离豌豆蛋白的技术功能特性和香气特征。实验设计结果显示，酶添加是驱动观察到变化的主要因素，而水解时间进一步增强了蛋白水解效应，温度对某些响应有次要但显著的影响。水解样品表现出高水溶性和低粘度，而过度水解对起泡能力和稳定性产生负面影响。基于技术功能特征，水解蛋白似乎适用于饮料或液体应用。本研究表明酶水解能显著调控干法分离豌豆蛋白的气味轮廓。多种与豆腥味相关的挥发性化合物在水解后减少，而大多数与正面或中性芳香属性相关的化合物不受影响。此外，一个有趣的发现是1,3-二-叔丁基苯显著促进了豆腥味，据研究人员所知，该化合物的气味特性此前未在文献中报道，值得进一步研究。尽管干法分离旨在尽量减少水和能耗，但引入受控的水相酶解步骤可被视为一种温和或混合策略来功能化蛋白配料。未来需要全面评估水和能耗，包括与传统湿法提取后水解的比较，以恰当评估整个工艺的影响。总体而言，研究结果支持将酶解作为后分离策略，通过调控功能性和香气特征来扩大干法分离豆类蛋白的应用潜力。特别是，水解可能成为缓解豆类蛋白配料主要局限性（即不良豆类风味）的有效方法。
