综述：骨髓微环境中的细胞外囊泡货物动态：从造血稳态到恶性转化

《Extracellular Vesicle》：Extracellular vesicle cargo dynamics in the bone marrow microenvironment: from hematopoietic homeostasis to malignant transformation

　　

骨髓（BM）微环境依赖细胞外囊泡（EV）介导的通讯维持造血稳态，并参与恶性转化过程中的细胞应答。EV作为分子穿梭载体，携带miRNA、蛋白质及脂质调控造血干细胞（HSC）的自我更新、静息与谱系定向分化。HSC来源的EV可通过自分泌/旁分泌信号刺激受体HSC中干细胞因子（SCF）的表达，间充质干细胞（MSC）来源的EV则通过TLR4激活与miRNA转移调控HSC分化。由四跨膜蛋白、ESCRT组分及脂质分选机制调控的EV生物发生通路，控制着HSC与BM细胞的货物选择与分泌。在恶性转化过程中，EV货物组成发生显著改变：白血病细胞释放富含免疫抑制因子、促生存信号及耐药介质的EV，重编程BM微环境以支持肿瘤生长。这些变化由缺氧、炎症信号、代谢重编程及化疗压力驱动，使肿瘤来源EV能够诱导HSC静息、极化巨噬细胞向免疫抑制表型转化并促进基质细胞重塑。恶性细胞与健康细胞来源EV的差异蛋白与miRNA谱具有诊断与预后价值，使EV同时成为生物标志物与治疗靶点。本综述探讨正常与恶性造血过程中EV的货物组成与功能作用，强调伴随疾病进展的动态变化及其临床意义。

1. 1.
   引言
   造血是终身生成各类血液与免疫细胞的过程，起源于造血干细胞（HSC）。HSC自我更新与分化的平衡直接影响造血稳态，该过程受骨髓（BM）微环境（又称“龛”）调控。龛是由HSC及其子代、内皮细胞、间充质干细胞（MSC）来源细胞（如成骨细胞、脂肪细胞）等共同组成的动态器官。生理与病理条件下，上述细胞均通过细胞间通讯影响并重塑BM微环境，通讯方式包括化学信号释放、胞质桥、膜蛋白直接互作、分泌分子及细胞外囊泡（EV）转移。EV通讯因其在健康与恶性状态中的作用及临床转化潜力成为研究热点。
   EV是释放至胞外的膜性囊泡，内含核酸、脂质、代谢物与蛋白质等生物活性分子，按起源与尺寸分为三类：微囊泡（100-1000 nm，由质膜出芽形成）、外泌体或小EV（30-150 nm，由多泡体（MVB）内的腔内囊泡经MVB与质膜融合后释放）及凋亡小体（50-5000 nm，由程序性死亡产生）。EV通过内吞、膜融合与受体互作三种主要机制将内容物递送至靶细胞，在多层次调控生物学过程并影响细胞命运。EV广泛存在于几乎所有体液，稳定性高且比亲本细胞更易储存操作，是疾病预后与诊断的生物标志物开发候选。自20世纪末以来，EV相关策略已进入多项临床试验，预计将应用于血液系统疾病与恶性肿瘤的临床实践。EV可利用生物工程技术装载特定货物，递送化学药物、治疗性蛋白质与核酸，因其可保护货物免受核酸酶与蛋白酶降解。在血液系统恶性肿瘤中，EV有望作为无创“液体活检”工具，为疾病分层与监测提供分子图谱。BM驻留细胞来源的EV介导多种生物学活动，包括HSC分化、归巢、免疫调节与异体移植支持，但不同龛种群如何协调这些功能、EV货物特异性如何实现仍是未解问题。近期实验室研究发现，HSC来源的EV通过自分泌/旁分泌机制特异性上调受体HSC中干细胞因子（SCF）的表达，增强HSC功能且无谱系偏倚，表明BM中EV介导的信号传递存在细胞类型特异性机制，需系统表征。
   本综述从三个整合视角探讨BM微环境中的EV介导通讯：首先描述HSC与基质细胞中调控EV生物发生的分子机器，强调调控通路如何控制货物选择；其次表征生理状态下维持HSC静息、分化与动员的EV货物（包括miRNA与蛋白质）；第三探讨血液系统恶性肿瘤中EV组成与功能的失调，聚焦促进免疫逃逸、耐药与环境重编程的动态变化，全程强调EV作为生物标志物与治疗靶点的临床潜力。
2. 2.
   BM来源EV在正常造血中的细胞间通讯
   BM内的细胞间通讯对健康造血至关重要。EV通过BM驻留细胞群的相互作用，调控HSC的关键特性，包括自我更新、分化、静息、凋亡与动员。其中自我更新的调控研究最为深入：液泡分选蛋白33B（VPS33B）参与EV成熟与分泌，Vps33b条件性敲除小鼠的HSC再植能力显著受损，人脐带血CD34⁺HSPC中VPS33B缺失导致HSPC数量减少、静息紊乱与凋亡升高，证实EV介导信号对HSC生理的核心作用。HSPC经EV生成抑制剂GW4869处理后，自我更新能力显著降低；靶向多泡内体锚定于质膜的Rab27a基因沉默会损害EV分泌，导致HSC再植潜能丧失。
   EV也参与HSPC分化过程：巨核细胞（MK）来源的EV通过ICAM-1、CD43、CD18与CD11b表位互作被内化，转移MK RNA以诱导HSC向新MK分化；缺氧条件通过调控EV分泌支持红系分化；MSC来源的EV通过TLR4信号诱导HSC向髓系偏倚扩增，干扰多能祖细胞（MPP）扩增。MSC来源的EV可减少HSC凋亡，维持BM微环境稳态；G-CSF刺激下多种基质细胞释放EV，促进HSC从BM向循环动员；MSC来源的EV还通过Egr1/Cdkn1a轴促进长期HSC（LT-HSC）静息。此外，MSC来源的EV通过促进血管生成维持BM微环境完整性，低氧培养下MSC分泌的EV富含Jagged-1，可激活HSC中Notch信号，增强自我更新、静息维持与克隆形成能力。
   除经典龛互作外，EV介导的串扰具有多样性：BM脂肪细胞来源的EV可将PPARγ、C/EBPα等成脂转录本转移至成骨细胞，使其基因表达向成脂偏移而牺牲成骨；骨骼肌细胞来源的EV可促进BM-MSC成骨分化并抑制单核细胞来源破骨细胞形成。脂肪细胞来源EV是否直接影响HSC功能仍待探索，全面表征所有BM驻留细胞群的EV及其互作是当前的重要挑战，凸显系统研究BM微环境EV介导通讯的必要性。
   上述EV对HSC生物学的多样功能效应引出了货物特异性如何实现的核心问题。蛋白质、RNA与脂质选择性纳入EV依赖于高度调控的生物发生通路，控制囊泡形成与货物分选。

2.1 HSC与骨髓基质中EV产生的调控通路

EV形成始于特定整合膜蛋白在微域中聚集，组织局部膜环境。微囊泡的微域形成于质膜，小EV的微域则形成于MVB的限制膜上，该过程由四跨膜蛋白家族（包括CD9、CD53、CD63、CD81、CD82）介导。四跨膜蛋白作为支架组装四跨膜蛋白富集微域（TEM），参与EV中蛋白质、脂质与核酸的选择性装载。HSC中CD53与CD63最初被鉴定为不对称分离标记，近期研究显示二者在HSC中高表达，缺失会导致静息丧失与HSC耗竭；CD82在HSC中高表达，至少部分通过支持TGF-β信号维持静息；CD9在人脐带血HSC中富集，支持归巢与再植能力，在成年小鼠HSC中与巨核系定向偏倚相关。

TEM平台招募诱导膜出芽的分子机器，通常表现为相对于胞质的向外弯曲，该过程至少部分由运输所需的内体分选复合物（ESCRT）组分介导。ALG-2互作蛋白X（ALIX）与肿瘤易感基因101（TSG101）是关键贡献者：ALIX可招募多配体蛋白聚糖（syndecan）及其胞质适配蛋白syntenin，并与TSG101互作，协调ESCRT依赖的EV形成。ESCRT依赖通路对HSC生物学的贡献尚未完全明确：多配体蛋白聚糖-2在HSC中高表达，缺失会显著损害再植能力，且其缺失与CD53、CD63、CD82类似，会破坏HSC静息维持；BM-MSC中多配体蛋白聚糖-2缺失也会损害野生型HSC的再植能力，提示ESCRT依赖的EV生物发生支持HSC与BM-MSC间的双向通讯。有趣的是，TSG101缺失的HSC体内长期再植能力增强，因TSG101参与货物选择，其缺失导致EV中线粒体蛋白与mtDNA积累，表明货物选择性对EV调控HSC功能的重要性不亚于生物发生本身。

微囊泡直接从质膜脱落，涉及ARF6与ARF1，二者促进肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化，触发肌动球蛋白收缩，促进新生囊泡断裂。目前尚无直接证据表明微囊泡在HSC与龛通讯中具有与小EV不同的功能效应，但ARAP3失活突变敲入会非细胞自主性地损害HSC自我更新，提示微囊泡可能参与HSC龛的负反馈信号，需更精细地表征BM通讯中的EV亚型。

相反，向MVB腔内出芽的囊泡形成腔内囊泡（ILV），MVB随后在RAB GTP酶（尤其是RAB7、RAB27a、RAB27b）作用下与微管结合并向质膜转运。低氧化代谢促进HSC中胆固醇积累与EV生物发生，该过程可被RAB27a下调完全阻断。胆固醇招募至ILV（涉及CD63的 cargo分选机制）会促进其分泌通路而非溶酶体降解。除胆固醇外，神经酰胺是HSPC中EV生物发生与货物调控的第二个关键脂质：中性鞘磷脂酶-2（nSMase2）驱动的神经酰胺依赖性EV分泌是HSPC再植的负调控因子，阻断该通路不仅减少EV输出，还选择性地耗竭EV中参与髓系分化与免疫激活的蛋白质，最终增强移植后的长期再植能力。综上，脂质组成不仅是BM来源EV的结构特征，更主动塑造货物选择性与造血功能。

这些发现支持HSC与骨髓基质骨细胞中EV生物发生存在进化保守且主动调控的机制，为深入理解BM龛内EV通讯提供了关键框架。

2.2 健康BM微环境中的EV来源miRNA

miRNA因强大的基因调控能力与在囊泡内的稳定性，成为EV功能研究中表征最充分的介质之一。miRNA被纳入EV后可随血液循环，免受RNase降解。在BM微环境中，miRNA调控HSC的增殖与分化。目前已报道少数特定miRNA参与维持正常造血的BM微环境生理功能：miR-486通过靶向SIRT1蛋白促进HSPC向红系定向扩增与分化；miR-144与miR-451同样被报道促进HSC红系分化；EV来源的miR-126通过调控黏附分子促进HSC动员。基质细胞来源的EV通过分泌丰富miRNA维持造血稳态，包括诱导HSC巨核细胞分化的miR-10a、参与粒系生成的miR-223、推动HSC向髓系分化的miR-196b，以及分别诱导单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞分化的miR-424、miR-150与miR-181。血小板可通过miR-1915-3p影响HSC向巨核细胞分化；成骨细胞来源的EV携带miR-29a可触发HSPC扩增。

破骨细胞来源的EV富含miR-324，通过靶向成骨分化负调控因子ARHGAP1促进基质细胞成骨分化；成骨细胞富集miR-143-3p，通过靶向CBFB mRNA抑制成骨分化并刺激破骨细胞形成与扩增；BM MSC来源的EV富含miR-22-3p，可通过抑制MYC/PI3K/AKT通路，以自分泌方式促进成骨分化。此外，在维持HSC静息与多能性的miR-221与miR-150已被发现于人脐带血CD34⁺细胞来源的EV中。这些发现强有力地支持EV介导的miRNA转移是造血环境中细胞间通讯的关键机制。

2.3 健康BM微环境中的EV来源蛋白标记

EV相关蛋白可分为两个功能不同的区室：表面暴露蛋白（位于EV膜外小叶）与囊内蛋白（包裹于EV腔室）。该拓扑差异具有直接功能后果：表面蛋白（包括四跨膜蛋白、整合素、黏附分子、受体配体）介导EV与胞外微环境的互作，决定靶细胞选择性，并可不依赖EV内化触发受体依赖性信号；囊内蛋白（包括胞质伴侣蛋白、ESCRT机器组分、转录调控因子）是EV内化后经内体加工递送的活性货物，需内化后才能发挥效应。这种区分在BM微环境中尤为重要，HSC-龛通讯的特异性不仅取决于哪些蛋白被包装进EV，还取决于它们是在细胞表面发挥作用还是内化后发挥作用。

EV蛋白高度富集于细胞骨架蛋白、胞质蛋白、热休克蛋白与质膜蛋白，以及囊泡运输与膜融合相关蛋白。虽无通用标记可唯一识别所有EV，但研究者依赖在不同EV亚群中富集的蛋白作为标记：四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82）是最具特征的表面EV标记，作为靶细胞识别与EV内吞的支架；胞质伴侣蛋白（14-3-3蛋白、HSP60、HSP70、HSP90）协助蛋白质折叠与细胞应激反应；MVB相关蛋白（TSG101、Alix、VPS4）属于ESCRT机器，参与囊泡生物发生与膜切割；此外还包括细胞骨架蛋白（肌动蛋白、微管蛋白、肌球蛋白I/II）、黏附蛋白、主要组织相容性复合体（MHC I/II）、膜融合与运输相关蛋白（膜联蛋白、Rab GTP酶）。四跨膜蛋白、MHC分子、黏附蛋白与膜联蛋白代表介导细胞识别与内吞的表面暴露组分，而HSP、ESCRT组分与细胞骨架蛋白则构成内化后递送的囊内区室。

Saunderson等报道CD169介导巨噬细胞捕获B细胞来源的EV；CD59与CD55被报道为免疫细胞EV标记。2020年Lyden团队定义了BM来源EV的标记，除已报道的HSPA8（Hsp70）、ALIX、HSP90-AB1/AA1、CD9、Flotilin-2（FLOT2）外，新增FN1、LGALS3PB、A2M、JCHAIN、HBB、GSN、ACTB、B2M、STOM、MSN、PRDX2、RAP1B、FLNA、CD36、CAVIN2、STX1作为BM来源EV群体的新标记。BM中已证实存在极化巨噬细胞特异性EV标记：CD68（M0）、CD86（M1）、CD206（M2）；CD31是BM微环境中内皮细胞来源EV的主要标记；骨钙化研究中定义SOST（骨细胞）、COL I（成骨细胞）、COL X（软骨细胞）为EV蛋白标记。成骨细胞来源的EV可通过膜联蛋白EV相关蛋白与矿化位点结合，促进BM-MSC成骨分化。深入造血BM驻留细胞层面，短期HSC（ST-HSC）来源的EV携带CD34标记；BM-MSC来源的EV通过TLR4与HSPC互作，激活TLR4信号以促进髓系扩增，偏倚HSC的造血再植潜能。这些细胞类型特异性的EV蛋白特征为区分BM来源EV的细胞起源、理解不同EV群体如何在龛中选择性靶向靶细胞提供了新兴框架。

1. 3.
   微环境应激下EV货物的动态重塑及其在恶性转化中的作用
   理解疾病进展中驱动EV货物改变的因素，可为EV获得促肿瘤功能提供机制见解，并提示潜在治疗干预点。恶性转化过程中，EV的分泌量与质量发生剧变，从支持正常造血转向促进免疫逃逸、耐药与环境重编程，以应对缺氧、炎症与治疗压力等微环境应激。
   缺氧是癌前与已确立恶性肿瘤中的基础微环境应激，驱动EV产生与货物组成的适应性改变。缺氧应激可通过增加EV分泌促进红系扩增，但该反应可能转向病理：红白血病细胞中，缺氧快速上调细胞内与分泌EV中的miR-486，EV介导的miR-486转移至健康HSPC后，通过抑制SIRT1促进红系分化，提示缺氧驱动的EV货物重塑可主动参与恶性红细胞生成。肿瘤微环境缺氧诱导HIF-1α稳定，直接调控EV生物发生与货物选择，持续缺氧触发病理性EV重塑以支持肿瘤进展：白血病中缺氧增加EV分泌，使货物富集促血管生成miR-210，增强内皮管形成与血管网络构建；缺氧抵抗的多发性骨髓瘤细胞释放富含miR-135b的EV，靶向内皮细胞中HIF-1抑制因子（FIH-1），激活HIF通路促进血管生成；此外缺氧通过HIF-1α结合PD-L1启动子，直接上调肿瘤来源EV表面的PD-L1表达，抑制T细胞活化以促进免疫逃逸。
   BM微环境中的慢性炎症深刻影响基质细胞的EV生物发生与货物组成。促炎细胞因子TNF-α与IFN-γ激活基质细胞，通过上调RAB27B依赖通路与NF-κB信号，从根本上改变其EV分泌模式。MSC的炎症 priming 驱动EV产量增加，并重塑其分子货物，包含免疫调节蛋白与改变的miRNA谱，可促使造血细胞命运向恶性转化。一旦恶性肿瘤确立，EV介导的串扰在急性髓系白血病（AML）中加剧：基质EV携带炎症miRNA（miR-155、miR-375）增强白血病细胞耐药性与侵袭力；慢性淋巴细胞白血病（CLL）中，暴露于慢性炎症信号的BM基质细胞释放含miR-202-3p、miR-146a、miR-451的EV，重编程微环境以支持肿瘤细胞存活；此外白血病来源EV可通过递送特定miRNA cargo极化巨噬细胞向免疫抑制M2表型转化，如慢性髓系白血病（CML）中肿瘤来源EV诱导M2极化并抑制抗肿瘤免疫。
   除炎症外，其他临床干预可短暂改变BM EV景观：G-CSF动员可增加活化中性粒细胞与单核细胞来源的BM EV，并修饰基质EV货物谱，但其对造血监视的长期意义仍有待确定。
   化疗暴露从根本上重塑恶性细胞与基质细胞的EV货物组成。AML中，BM-MSC响应化疗应激的白血病细胞，释放EV通过多种机制赋予化疗耐药性：递送抗凋亡蛋白MCL-1、药物外排泵MDR1与MRP1、翻译起始因子eIF4A以维持残留白血病细胞的蛋白质合成。反之，白血病来源EV重编程BM-MSC，使其表达IL-6、GAS-6、GALECTIN-3等促生存因子，形成化疗保护性龛以庇护微小残留病（MRD）。关键的是，复发患者分离的白血病来源EV携带显著高于初治患者的耐药介质，这些“耐药EV”可通过递送耐药基因与活性氧（ROS）清除分子，将化疗耐药表型转移至初治细胞。CLL中，基质细胞来源EV可保护恶性B细胞抵抗氟达拉滨、伊布替尼、维奈克拉等八种化疗药物。这些治疗诱导的EV改变形成了自我强化循环：治疗本身重编程微环境以 favor 耐药克隆存活，推动疾病进展为更具侵袭性的状态。
2. 4.
   BM来源EV在血液系统恶性肿瘤中的细胞间通讯作用
   EV参与恶性转化、耐药与转移。白血病来源EV可重编程BM微环境，抑制正常造血与抗肿瘤免疫，从而促进治疗耐药。许多血液系统恶性肿瘤患者血液中EV水平高于健康人，且EV尺寸因疾病而异，可作为潜在的诊断/预后因子。EV在肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）串扰中的作用仍未完全明确：AML来源EV可诱导白血病骨髓中残留HSC进入静息，说明恶性EV如何破坏正常造血。血液系统恶性肿瘤是一个涉及癌细胞与TME动态互惠互作的进化与生态过程，TME由免疫细胞、基质细胞、成纤维细胞、细胞外基质成分、血细胞与淋巴管共同组成。癌细胞与TME的动态网络与串扰允许肿瘤发育与生长，通过多种策略在多层面影响生物学过程。体内研究显示，AML来源EV可诱导与AML细胞植入后相似的BM微环境功能改变，尤其靶向BM微环境中的基质与内皮细胞；AML来源EV还可增强成骨发育负调控因子（如DKK-1）的表达，损害BM-MSC的分化潜能，抑制正常造血。CLL中，MSC来源EV增强抗凋亡蛋白（MCL-1、BCLXL、XIAP）表达，促进CLL细胞的SDF-1诱导迁移。多发性骨髓瘤（MM）细胞来源EV可影响周围微环境：抑制成骨分化并通过EV介导信号促进破骨细胞生成，MM来源EV通过激活IRE1alpha/XBP1轴携带未折叠蛋白反应（UPR）信号分子，促进骨吸收。急性淋巴细胞白血病（ALL）来源EV可在体外通过转移促增殖、促生存与抗凋亡因子，促进白血病与非白血病B细胞的增殖与存活。除蛋白质与miRNA货物外，白血病EV的脂质组成已成为其病理活性的功能相关维度：ALL来源EV的脂质组学分析显示，相较于非白血病细胞EV，其胆固醇、磷脂酰胆碱与鞘磷脂富集；关键的是，ALL EV的脂质组分（而非单独蛋白质或RNA组分）可直接破坏BM中靶向干细胞的静息并促线粒体激活。这些发现将EV脂质货物定位为白血病驱动龛破坏的未被充分重视却功能活跃的中介。
   恶性EV的复杂作用可通过三个相互关联的视角理解：（i）其对免疫细胞的影响以实现肿瘤逃逸；（ii）其对基质细胞的影响以重塑支持性微环境；（iii）介导这些促肿瘤功能的特定货物分子（miRNA与蛋白质）。

4.1 血液系统恶性肿瘤细胞来源EV对免疫系统的影响

免疫系统在清除肿瘤细胞中起关键作用，肿瘤抗原（包括突变蛋白或异常翻译后修饰）暴露以实现免疫识别。肿瘤相关抗原（TAA）的丢失或掩蔽是允许肿瘤生长的免疫逃逸关键机制，EV介导的通讯也参与免疫逃逸。癌症来源EV递送多种免疫抑制因子（miRNA、DNA、促凋亡介质、代谢物、酶），调控免疫激活与应答。白血病细胞来源EV可通过下调T细胞受体T3 ζ链（CD3ζ）与酪氨酸蛋白激酶（JAK3）表达、促进Fas/FasL介导的凋亡影响CD8⁺T细胞。自然杀伤（NK）细胞