在胚胎发育过程中，将纳米MO活体物质通过浸泡方式传递给太平洋牡蛎（Crassostrea gigas），会干扰其生殖腺的发育

《Marine Biotechnology》：Bath-Immersion Delivery of nanos-MO-Vivo During Embryogenesis Perturbs Gonadal Development in the Pacific Oyster (Crassostrea gigas)

　　摘要：在水产养殖物种中，早期胚胎发生过程中与生殖系相关的过程的调控是性腺发育的重要方面。在本研究中，我们利用纳米靶向的Morpholino-Vivo（nanos-MO-Vivo）通过浸泡法在胚胎发生期间进行递送，以暂时干扰太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）的早期生殖系发育。受精后，将100 μM的nanos-MO-Vivo浸泡6小时，有效抑制了生殖系标记物的表达，同时保持了胚胎的存活率。在囊胚阶段的转录组分析显示，PGC标记物（vasa, Piwil1）和与生殖系相关的调控途径出现了协调性的下调。长期饲养结果表明，纳米分子的短暂胚胎干扰导致了成年性腺发育的持续受损，表现为性腺覆盖面积减少和生殖组织减少。基于单细胞转录组数据的计算机模拟分析进一步支持了纳米分子在PGC群体中的调控作用。Crassostrea物种间nanos基因的高度序列保守性，以及C. angulata和C. nippona中观察到的类似下调反应，表明这些效应并不局限于单一的牡蛎物种。本研究将早期生殖系调控的短暂干扰与长期的性腺表型联系起来，为软体动物水产养殖中的生殖调节提供了见解。

引言：太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）是全球养殖最广泛的软体动物物种之一（Jiang等人，2024年）。牡蛎的季节性性腺发育会消耗大量能量，从而影响肉质，并在繁殖期间增加夏季死亡的风险（Parra等人，2005年；Cotter等人，2010年）。因此，理解控制性腺发育的生物学过程是牡蛎生殖生物学中的一个核心课题。性腺发育起源于早期胚胎发生过程中原始生殖细胞（PGCs）的指定、维持和分化。PGCs是生殖系的起源，并为后续的配子发生提供细胞基础（Lesch和Page，2012年）。研究表明，在胚胎发生过程中干扰PGC相关过程会对多种水生物种的性腺形成和生殖能力产生持久影响（Li等人，2014年；Nishimura和Tanaka，2022年；Xu等人，2023年），这突显了早期胚胎发生是一个可以调节生殖轨迹的关键时期。在与生殖系相关的基因中，nanos是一个在各种后生动物中都保守的调控因子（De Keuckelaere等人，2018年）。在诸如Oreochromis niloticus和Oryzias latipes这样的鱼类中，干扰nanos会导致严重的生殖系缺陷和不孕（Li等人，2014年；Nishimura和Tanaka，2022年）。在几种软体动物中也发现了nanos的同源物，包括C. gigas（Xu等人，2018年）、C. hongkongensis（Tong等人，2015年）和Pinctada martensii（Matsumoto等人，2013年）。在C. gigas中，已有报道表明nanos转录本在早期发育过程中由母体沉积并在生殖细胞中富集（Xu等人，2018年），这支持了将其作为干扰早期生殖系相关过程的分子靶点。与细胞穿透载体结合的Morpholino寡聚物（MO-Vivo）提供了一种在早期发育过程中暂时抑制目标转录本翻译的实用方法。重要的是，MO-Vivo可以通过简单的浸泡法递送，从而能够处理大量胚胎。最近在东部牡蛎（C. virginica）中已经证明了基于浸泡的MO递送方法的可行性，使其成为早期胚胎发生功能研究的可扩展实验工具（Xu等人，2025年）。然而，其在C. gigas中的适用性、优化效果以及长期发育后果仍不甚明了。在本研究中，我们利用纳米靶向的MO-Vivo通过浸泡法在胚胎发生期间进行递送，以暂时干扰C. gigas的早期生殖系相关过程。我们通过生殖系标记物的表达评估了分子反应，检查了早期发育过程中的转录组变化，并评估了对成年性腺发育的长期影响。通过将早期生殖系调控的短暂干扰与后期的生殖表型联系起来，这项工作为牡蛎性腺形成的发育可塑性提供了见解，并有助于更好地理解软体动物水产养殖中的生殖调节机制。

材料与方法：
**亲本和实验设计**：从中国山东的荣城、福建的漳州和山东的 Rushan 分别收集了两年龄、性成熟的太平洋牡蛎（壳高：50.45 ± 8.39 mm；总重量：42.15 ± 11.12 g）、C. angulata（壳高：48.20 ± 7.80 mm；总重量：53.00 ± 12.50 g）和C. nippona（壳高：59.30 ± 11.92 mm；总重量：46.80 ± 15.65 g）。在产卵前，这些牡蛎被维持在标准的孵化场条件下。每个实验使用单对交配（一只雌性×一只雄性）产生的全同胞胚胎。除非另有说明，否则不同的实验使用独立的单对交配进行。
**微注射实验**：为了验证不同温度条件下nanos-MO-Vivo的敲低效率，进行了微注射实验。所有后续的分子、转录组、幼体和成体表型分析均按照优化的方案通过浸泡法进行递送。

**Morpholino的设计与合成**：基于注释的参考基因组（cgigas_uk_roslin_v1，GCF_902806645.1），设计了一种针对C. gigas的nanos基因的翻译阻断Morpholino寡聚体。该Morpholino序列与nanos mRNA的翻译起始区域互补（图S1）。nanos基因位于连锁群4上（GenBank登录号NC_047562.1）。Morpholino骨架由通过非离子磷酸二酰胺键连接的吗啉环组成，具有抗核酸酶降解的能力。为了实现无载体细胞摄取，寡核苷酸在3′端与Vivo分子转运蛋白（Vivo亚基）结合，后者由八聚胍树状大分子组成。nanos-MO-Vivo由Gene Tools, LLC（美国俄勒冈州Philomath）合成并纯化。

**Nanos-MO-Vivo的微注射**：微注射专门用于验证nanos-MO-Vivo的翻译敲低效率。使用PLI-100 A Pico-Injector微注射器（Warner Instruments）和拉制的玻璃毛细管针进行微注射，操作方法遵循Yu等人（2019年）之前描述的程序。大约150个来自单对交配的受精卵在受精后立即在受精卵阶段进行注射。每个胚胎注射约1 nL的nanos-MO-Vivo溶液，最终Morpholino浓度为80、100或120 μM。对照组胚胎注射等量的酚红溶液。注射组和相应的对照组各进行三次生物学重复实验。注射后的胚胎在25 ℃或20 ℃下培养。为了评估敲低效果，在囊胚阶段（受精后4–6小时）收集胚胎进行基因表达分析。

**Nanos-MO-Vivo的浸泡递送**：进行了初步实验以优化浸泡时间、温度和浓度。为了评估浓度的影响，将受精卵浸泡在不同浓度的nanos-MO-Vivo（20、60、100、120、180和240 μM）中，温度为20 ℃。对于高浓度组（180 μM和240 μM），采用了逐步降低浓度的方案以确保胚胎存活：在浸泡后5.5小时和1小时分别用海水稀释培养液，使最终浓度分别为90 μM和120 μM。基于这些试验，选择了用于所有后续实验的受精后浸泡方案。浸泡处理使用来自同一亲本批次的胚胎进行三次生物学重复实验。浸泡过程中的胚胎密度保持在每μL约400个胚胎。浸泡后，用新鲜过滤的海水彻底冲洗胚胎，并转移到含有过滤海水的100 L桶中，在25 ℃下培养。

**幼体和成体饲养**：幼体和成体的饲养遵循Li等人（2011年）描述的方案，根据发育阶段和喂养状态调整饮食。具体来说，D形幼体喂食Isochrysis galbana，而后续发育阶段的幼体则喂食Platymonas sp.和Chlorella vulgaris的混合饲料。变态后（21 dpf），幼体被转移到室外池塘进行一周的适应期，然后放入笼子中，在中国山东省威海湾（36.45°N, 121.42°E）的筏线上进行养殖。270天时，每组随机选取31个个体进行性别鉴定和性腺覆盖面积（GCA）分析。

**表型和组织学分析**：受精率在受精后4小时计算（每组三个重复）。使用Image-Pro Plus（v6.0）在第1天、第6天、第11天和第27天测量每组30个幼体的壳高。幼体存活率根据第1天的密度计算，270天的成体存活率根据随机选取的绳索上的定居密度估计。受精率、孵化率和存活率（百分比数据）在统计分析前转换为比例并进行了反正弦平方根转换。对于每个时间点和每个生物学重复（A-C），使用基于转换数据的独立样本t检验评估WT和MO之间的差异。

**RNA提取和定量PCR分析**：对于微注射实验，使用MicroElute? Total RNA Kit（OmegaBioTek，美国）从囊胚胚胎中分离总RNA。准备三个生物学重复样本，每个样本包含150个胚胎。对于浸泡实验，使用Trizol（Invitrogen，美国）从胚胎中分离总RNA。使用Evo M-MLV RT Mix Kit和gDNA Clean for qPCR Ver.2（Accurate Biotechnology，中国）合成第一链cDNA。vasa、gata3、pax5和hoxa7的引物列在表S1中。它们的NCBI基因ID、连锁群、染色体位置和链信息列在表S2中。qPCR在LightCycler 480 II系统（Roche，瑞士）上进行，使用Evo M-MLV One Step RT-qPCR Kit（SYBR）（Accurate Biotechnology，中国），反应体积为20 μL。PCR扩增的循环参数如下：95 ℃预热30秒，然后是40个循环，每个循环95 ℃ 5秒和60 ℃ 30秒。从MolluscDB 2.0（Liu等人，2025）中鉴定C. angulata和C. nippona中的核糖体蛋白S18（RS18）和vasa的同源物。使用熔解曲线分析评估扩增特异性（表S1）。相对表达使用2?ΔΔCt方法计算，以RS18作为内参（Du等人，2013年）。

**全 mount in situ杂交**：全 mount ISH按照Fabioux等人（2004年）的方法进行。使用DIG RNA Labeling Kit（Roche，瑞士）生成DIG标记的核探针（表S1），并使用GeneJET kit（Thermofisher，美国）进行纯化。甲醇保存的囊胚阶段胚胎在分级甲醇-PBST中重新水化，用蛋白酶K（1 mg/mL）渗透，然后在TEA中用乙酸酐乙酰化，再用4%的甲醛固定。胚胎在预杂交缓冲液中平衡，并在65 ℃下与DIG标记的反义探针杂交过夜（200–500 ng/mL）。杂交后洗涤在预杂交缓冲液、2×SSC和0.2×SSC中进行。胚胎转移到MABT中，用MAB封闭剂封闭，然后与anti-DIG-AP Fab片段（1:5000；Roche，瑞士）孵育。洗涤后，在碱性磷酸酶缓冲液中用NBT/BCIP进行显色检测。反应在体视显微镜下监测，用PBS停止，然后进行 mounting和成像。

**转录组测序与分析**：使用Tritizol（Invitrogen，美国）从处理组和对照组的囊胚中提取总RNA。六个文库（三个处理组和三个对照组）在Illumina NovaSeq 6000上进行测序，读取长度为150 bp的配对末端序列。原始读数使用fastp（v0.22.0）处理，以去除接头序列、低质量读数和含有过多模糊碱基的读数。清洁读取数据使用HISAT2（v2.2.1）和默认设置与C. gigas参考基因组（cgigas_uk_roslin_v1；GCF_902806645.1）对齐。在R中进行了主成分分析（PCA）和样本相关性分析，使用标准化表达值来评估样本聚类和可重复性。差异表达分析使用DESeq2（v1.50.2）基于原始读取计数进行。调整后的P值<0.05且|log2倍数变化|≥1的基因被认为是显著差异表达的。基因表达水平被标准化为每百万转录本（TPM）以便于可视化和跨样本比较表达水平。GO和KEGG富集分析使用clusterProfiler包（v4.10.0）进行。功能注释使用从基因到术语映射生成的定制GO和KEGG注释数据库进行分配。P值<0.05的富集术语被认为是统计上显著的。通过qPCR对RNA-seq鉴定的DEGs进行了实验验证。相对基因表达使用2?ΔΔCt方法计算，以RS18作为内部对照，并得出纳米MO-Vivo处理组和对照组之间的log2倍数变化，并与批量RNA-seq的结果进行比较以评估表达一致性。

所有数据均以平均值±标准差（SD）呈现。统计分析使用SPSS 26进行。对于涉及单一变量的实验，例如不同的浸没浓度或持续时间，首先进行单因素方差分析（ANOVA），然后进行Tukey的多重比较测试。对于评估浸没温度和持续时间联合效应的实验，使用双因素ANOVA来评估主效应和交互作用。实验至少包括三个生物学重复。P<0.05被认为是显著的。

为了建立评估C. gigas中纳米MO-Vivo介导的生殖系扰动的可靠框架，我们首先考虑了早期胚胎发生过程中生殖系标记表达的时间动态。先前的研究表明，vasa是一个母系沉积的基因，是牡蛎原始生殖细胞的保守标记，在囊胚阶段之后转录本丰度急剧下降（Andrews和Oliver 2002；Fabioux等人2004）。因此，囊胚阶段作为检测早期处理相关vasa表达变化的早期发育窗口。为了建立评估C. gigas早期胚胎发生过程中纳米MO-Vivo介导的分子扰动的实验框架，最初使用显微注射作为方法学参考。在标准培养条件下（25℃），胚胎在受精后4-5小时内达到囊胚阶段，为纳米MO-Vivo的采样提供了相对较短的暴露时间（图1A）。在这个时间点，与对照组相比，处理过的胚胎中没有检测到vasa表达的显著减少（图1A）。为了延长暴露时间同时保持在vasa可检测的窗口内，随后通过将培养温度降低到20℃来减缓早期胚胎发育。在25℃和20℃下收集的WT胚胎的vasa mRNA水平没有显著差异（图S2A）。在这些条件下，胚胎在受精后大约5-6小时达到囊胚阶段，注射了100-120 μM纳米MO-Vivo的胚胎显示出相对于对照组胚胎vasa表达的显著减少（图1B，P<0.05）。全mount ISH进一步显示处理过的胚胎中的vasa信号强度低于未处理的胚胎（图1C，图S2B，图S2C）。与壳形成相关的标记（gata3、pax5和hoxa7）的表达保持不变（图1D；Liu等人2015；Hu等人2024）。这些观察结果表明，早期纳米MO-Vivo处理与囊胚阶段胚胎发生过程中的vasa表达改变有关。

图1
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通过显微注射实现纳米MO-Vivo敲低的效率。(A, B) 在25℃（A）和20℃（B）培养的胚胎中注射不同浓度的纳米MO-Vivo后vasa表达的量化。星号表示显著差异（*P<0.05；ns，无显著差异）。(C) 全mount原位杂交显示囊胚阶段对照组（WT，n=6）和纳米MO-Vivo处理组（MO，n=6）胚胎中vasa mRNA的定位。(D) 纳米MO-Vivo显微注射后vasa、gata3、pax5和hoxa7的表达

与显微注射揭示的时间依赖性要求一致，受精后浸泡纳米MO-Vivo只有在足够的暴露时间后才能检测到敲低效果。在20℃下，浸泡在纳米MO-Vivo中的胚胎在囊胚阶段采样时显示出vasa表达的显著减少（6小时，P<0.05），而在更早的发育阶段（2.5 hpf，4细胞；4 hpf，早期分裂；5 hpf，桑椹胚）采样的胚胎没有检测到变化（图2A）。剂量-反应分析进一步显示，增加纳米MO-Vivo浓度可以提高敲低效率，直到中等范围，从20 μM到100 μM逐渐增强vasa抑制，100 μM到180 μM之间没有额外效果，而在240 μM时效率降低（图2B），而更高浓度与胚胎性能受损相关（图S2D）。值得注意的是，在240 μM时没有恢复到活的胚胎（图S2D）。考虑到敲低效果和发育可行性，选择在延迟发育条件下受精后以100 μM进行浸泡进行后续分析。

图2
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评估纳米MO-Vivo浸泡参数以实现稳健的敲低。(A) 在100 μM（左）和120 μM（右）纳米MO-Vivo浸泡后早期发育阶段的vasa表达谱。星号表示显著差异（*P<0.05；ns，无显著差异）。(B) 不同纳米MO-Vivo浸泡浓度下的vasa表达水平。不同字母表示显著差异（P<0.05）

为了表征早期纳米扰动对胚胎发生过程中生殖系扰动的转录组后果，对受精后用100 μM纳米MO-Vivo浸泡的囊胚阶段胚胎进行了转录组测序，并与相应的对照样本进行了比较（图S3A，S3B，表S3）。与靶向生殖系扰动一致，原始生殖细胞标记vasa和Piwil1在纳米MO-Vivo处理的胚胎中的表达水平显著降低，与对照组相比（图3A；Fabioux等人2004；Xu等人2020）。差异表达分析共鉴定出216个差异表达基因（DEGs），包括105个上调基因和111个下调基因（图S3C，表S3）。基因富集分析显示，下调的DEGs与干细胞分化、间充质细胞分化和原肠胚形成相关的生物过程显著相关（图3C）。相比之下，上调基因没有显示出与发育GO术语的显著富集。

图3
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纳米MO-Vivo敲低后的基因组规模转录改变。(A和B) MO和WT胚胎中的vasa和Piwil1表达（TPM）。条形图显示平均值±标准差；点是生物学重复（每组n=3，*P<0.05，**P<0.01）。(C) 下调基因的前20个GO富集术语（P<0.05）。(D) 处理组和对照组胚胎之间DEGs的KEGG富集。条形图表示基因计数；橙色表示上调，蓝色表示下调（P<0.05）。(E) MO和WT胚胎中的BAMBI、noggin-2和nodal表达（TPM）。条形图显示平均值±标准差；点是生物学重复（每组n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）

KEGG通路分析进一步显示，下调的DEGs在几个发育和代谢通路中富集，包括TGF-β信号通路和酪氨酸代谢（图3D）。值得注意的是，TGF-β信号通路的多个组分或调节因子，如BAMBI（LOC105343871）、noggin-2（LOC105342853）和nodal（LOC105342005），在纳米MO-Vivo处理后表达减少（图3E）。上调的DEGs主要富集在氨基酸和硒化合物代谢通路中（图3D）。与显微注射实验中观察到的特异性一致，代表性体细胞发育标记（gata3、pax5和hoxa7）在转录组数据中的表达没有显著改变（图S3C）。七个代表性DEGs的qPCR验证确认了与RNA-seq结果一致的表达趋势（图S3D）。

总体而言，这些结果表明，短暂的胚胎纳米扰动伴随着生殖系相关和发育转录程序的协调转录变化。

为了确定早期胚胎发生过程中的短暂纳米扰动是否会导致持续的生殖后果，胚胎在20℃下用100 μM纳米MO-Vivo浸泡6小时后被培养至成年，并检查其生殖腺发育（图4A和B）。处理过的个体与对照组相比表现出持续的壳生长减少（图4C）。生存分析显示，MO处理组的主要减少发生在第1天，而在后续时间点的较低存活率主要反映了这种早期差异的持续（图4D和图S4）。在成年阶段（270 dpf），在纳米MO-Vivo处理的牡蛎中观察到生殖腺组织的明显改变。MO处理组和对照组中的成年牡蛎都表现出明显的雄性偏倚，MO处理组的雄性比例在80.65%到93.55%之间，而对照组在70.97%到100%之间。组织学分析显示，一部分处理过的个体（6.4%-9.7%）缺乏可辨别的生殖细胞，而更大比例（32.26%-64.51%）表现出生殖腺发育受损，其特征是广泛的结缔组织和显著减少的生殖细胞生成组织（图4E）。相比之下，所有对照组的牡蛎都显示出充满成熟生殖细胞的发育良好的生殖腺管。处理样本的平均GCA（65.34%±29.78%）显著低于对照组（P<0.05；图4F）。

图4
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来自纳米MO-Vivo处理过的成年个体显示出生殖腺发育的显著抑制。(A) 纳米MO-Vivo浸泡处理的工作流程。(B) 纳米MO-Vivo敲低效率的qPCR验证。星号表示显著差异（*P<0.05）。(C) 不同幼虫阶段纳米MO-Vivo处理组和对照组之间的壳高度比较。值以平均值±标准差表示。星号表示显著差异（*P<0.05）。(D) 不同发育阶段纳米MO-Vivo处理组和对照组之间的存活率比较。统计分析是在反正弦平方根转换的数据上进行的，而值以原始百分比的平均值±标准差表示（n=3）。星号表示显著差异（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01）。(E) 纳米MO-Vivo处理后270 dpf的生殖腺发育。缺乏生殖细胞的处理个体（a面板），生殖腺面积减少的处理个体（b面板），以及对照组的生殖腺（c面板）。(F) 纳米MO-Vivo处理后的生殖腺覆盖面积（GCA）。缩写：CT，结缔组织；St，生精小管；Sz，精子；S，精细胞

为了评估纳米MO-Vivo系统在物种间的适用性，我们检查了C. angulata（Ca-nanos-like，XP_052705629.1）和C. nippona（Cn-nanos-like CNI_021513-RA）中的纳米同源物，它们分别与C. gigas纳米的核苷酸同一性为99.13%和97.83%（图S5）。纳米MO-Vivo序列与C. angulata的转录本完全互补，并且与C. nippona的转录本有一个核苷酸不匹配（图S5）。尽管在纳米MO-Vivo处理后幼虫孵化率显著降低（P<0.05；图5A），在C. gigas中为30.15±5.00%，在C. angulata中为30.67±4.16%，在C. nippona中为14.33±4.93%，但在所有三个物种中，纳米MO-Vivo浸泡一致导致囊胚阶段vasa表达的显著减少（P<0.05；图5B），分别比对照组减少了57%、45%和31%。总体而言，这些结果表明纳米MO-Vivo靶点在密切相关的Crassostrea物种中是保守的，并且在类似的实验条件下可以实现类似的生殖系标记抑制。

图5
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牡蛎中纳米MO-Vivo的跨物种验证。(A) 三种牡蛎物种受精卵在纳米MO-Vivo处理后的孵化率比较分析。不同字母表示显著差异（P<0.05）。(B) qPCR评估显示纳米MO-Vivo的种间适用性。星号表示显著差异（*P<0.05）。Cg：Crassostrea gigas；Ca：Crassostrea angulata；Cn：Crassostrea nippona

我们的研究表明，早期胚胎发生过程中生殖系相关调控的短暂扰动可能导致C. gigas中生殖腺发育的持续改变。在受精后窗口期间通过显微注射和浸泡方式传递纳米MO-Vivo有效地抑制了囊胚阶段的PGC标记，尽管评估后期发育阶段将提供更全面的证据。重要的是，这种早期和暂时的分子扰动与成年生殖腺发育的长期缺陷相关，包括生殖腺管形成减少和生殖细胞生成活性降低。这些发现突显了牡蛎生殖腺发育对早期生命阶段短暂干扰的敏感性，并建立了胚胎生殖系调控与后期生殖表型之间的发育联系。

纳米MO-Vivo介导的扰动的有效性强烈依赖于发育时间和暴露持续时间。在牡蛎中，纳米和vasa转录本是母系沉积的，并在原肠胚形成之前迅速下降（Fabioux等人2004；Xu等人2018），这定义了一个狭窄的发育窗口，用于检测早期扰动的分子反应。后期发育阶段可能有助于评估下游表型后果。在标准培养条件下，胚胎迅速进展到囊胚阶段，限制了有效的暴露时间。通过降低培养温度减缓早期发育延长了囊胚前窗口，使得生殖系标记的抑制更加显著。然而，不能完全排除低温可能增强了Morpholino效果的可能性。这些结果强调了发育速率在塑造早期生命干预结果中的重要性，并且与其他水生物种的观察结果一致，这些物种中生殖细胞的扰动高度依赖于发育阶段（Wong和Zohar 2015）。转录组分析进一步支持了早期纳米干扰选择性地影响与生殖细胞相关的调控程序的结论。批量RNA-seq显示，参与发育信号通路的PGC标记物和相关基因（包括TGF-β通路的组成部分）被协调下调，而TGF-β通路在早期发育过程中与体细胞和生殖细胞之间的相互作用有关（Cantú等人2016；Huvet等人2012；Oikawa等人2025）。暴露于较高浓度（特别是240 μM）的纳米-MO-Vivo的胚胎表现出发育进程延迟，表明过高的处理水平可能会干扰正常的胚胎发育。处理过的牡蛎存活率降低进一步表明，早期暴露于纳米-MO-Vivo可能与胚胎和幼体发育性能受损有关，尽管也不能排除MO-Vivo处理的非特异性效应。这些观察结果与之前在C. virginica中的浸泡研究一致，那些研究也显示随着MO-Vivo浓度的增加，幼体存活率呈浓度依赖性下降（Xu等人2025）。综上所述，这些发现表明，早期纳米-MO-Vivo处理可能会影响超出生殖细胞相关调控的更广泛的发育过程。

尽管对成年生殖腺发育有显著影响，但纳米干扰并未导致牡蛎的生殖细胞完全丧失。在部分处理过的个体中观察到了生殖细胞的完全丢失，而在许多其他个体中生殖细胞仍然存在，这表明仅靠纳米敲低作用不足以完全消除生殖细胞。然而，评估可存活配子的产生对于更全面地评估与保留的生殖细胞相关的功能生殖后果非常重要。这一结果与斑马鱼的研究形成对比，在斑马鱼中，关键决定因素的破坏可能导致生殖细胞的完全丢失（Wong和Zohar 2015）。这里观察到的部分表型可能反映了不同物种在生殖细胞决定和维持方面的差异，因为软体动物中控制PGC分化的分子层次结构不如脊椎动物清晰。在C. nippona和C. angulata中，纳米-MO-Vivo处理后，纳米靶标区域的序列高度保守，并伴随着生殖细胞标记物的类似抑制。这种保守性表明，观察到的发育反应并非C. gigas所特有，而是反映了该属内生殖细胞调控的共有特征。尽管C. nippona中的单个A到C的替换略微降低了敲低效率，但仍观察到了vasa表达的显著抑制。这种对有限序列不匹配的耐受性与Morpholino寡核苷酸已知的杂交特性一致，即尽管存在轻微的靶标不匹配，它们仍能保持活性（Wesolowski等人2011）。总的来说，这些结果表明，基于浸泡的纳米干扰为研究牡蛎早期生殖腺发育的调节提供了一个可靠的实验框架，对于研究密切相关的养殖物种也具有潜在意义。

结论

本研究证明，纳米-MO-Vivo浸泡是一种有效的策略，可以破坏太平洋牡蛎中PGC的形成。通过优化发育时间和暴露条件，我们实现了生殖细胞标记物的一致抑制，同时伴随着成年生殖腺发育的严重受损。转录组数据进一步揭示了发育和生殖细胞相关信号通路的改变，而序列保守性支持了这种方法在多种Crassostrea物种中的适用性。总体而言，这些发现加深了我们对软体动物生殖细胞调控的理解，并为研究牡蛎生殖能力的发育起源提供了实验框架。