2型糖尿病中二甲双胍相关代谢基因表达改变的表征：来自患者血液样本与HepG2细胞的证据

《Bratislava Medical Journal》：Characterization of Metformin-Associated Metabolic Gene Expression Alterations in Type 2 Diabetes: Evidence from Patient Blood Samples and HepG2 Cells

背景
二甲双胍是2型糖尿病（T2DM）的一级治疗药物，但其完整的生化作用机制仍未被充分阐明。

目的
本研究旨在采用基于实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）的表达谱分析及生物信息学分析，表征2型糖尿病患者以及人肝细胞癌细胞系HepG2中与二甲双胍相关的代谢基因表达改变。

方法
研究人员分析了4组血液样本（每组n＝20），分别为健康对照、糖尿病前期个体、未接受治疗的重度2型糖尿病患者以及接受二甲双胍治疗的2型糖尿病患者。此外，还评估了经二甲双胍处理的HepG2细胞。共检测46个代谢相关基因，采用RT-qPCR进行评估。并进行了京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析和基因-代谢物网络分析。

结果
二甲双胍治疗与多类代谢相关基因表达改变相关，包括葡萄糖摄取相关基因（SLC2A2、HK2）、脂质代谢相关基因（ACLY、SCD）以及能量平衡相关基因。通路分析提示，二甲双胍影响糖酵解、三羧酸（TCA）循环、脂肪酸生物合成及氧化还原过程。基因表达改变与预测代谢物节点相关，包括NADP、棕榈酸和ATP。与未治疗患者相比，接受二甲双胍治疗的患者表现出与相对改善的代谢谱相关的基因表达模式。

结论
二甲双胍治疗与2型糖尿病中代谢基因表达的协同变化相关。该整合性策略结合了来源于患者的数据、体外HepG2模型以及基因-代谢物网络，从系统层面提供了对二甲双胍相关代谢改变的认识。对这些结果的解读应结合模型局限性以及预测代谢物关联加以审慎考虑。

本文发表于《Bratislava Medical Journal》，聚焦二甲双胍在2型糖尿病（T2DM）中的代谢调控效应，核心目标是从转录层面刻画其相关代谢基因表达改变，并通过患者血液样本与HepG2肝细胞模型的整合分析，呈现药物相关代谢重编程的系统性特征。研究背景在于，T2DM是一种以慢性高血糖、胰岛素抵抗和多通路代谢紊乱为特征的复杂代谢性疾病，且肥胖是其重要危险因素。虽然二甲双胍已被广泛确立为一线治疗药物，具有给药方便、成本较低和不良反应相对温和等优势，但其完整的生化作用机制仍未完全阐明。既往研究多强调其与腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK，细胞能量感应通路）激活、肝糖输出抑制以及糖脂代谢调节有关，但不同疾病阶段、不同生物系统中的转录变化特征仍缺乏整合性描述。因此，开展本研究的必要性在于：一方面识别糖尿病前期、重度未治疗T2DM及二甲双胍治疗T2DM之间的代谢基因表达差异；另一方面借助体外肝细胞模型识别共享与模型特异性的转录模式，从而为理解二甲双胍相关代谢改变提供系统层面的证据。

研究人员围绕葡萄糖代谢、脂质代谢、三羧酸（TCA）循环、丝氨酸/甘氨酸/一碳代谢以及氧化还原稳态等过程，对46个代谢相关基因进行了定量检测，并进一步结合KEGG通路富集与基因-代谢物网络预测分析，比较不同人群组别及HepG2细胞经二甲双胍处理后的表达变化。研究得出的总体结论是：二甲双胍治疗与T2DM中广泛且协调的代谢基因表达改变相关，尤其涉及糖酵解、脂质代谢、TCA循环和氧化还原过程；与未接受药物治疗的重度T2DM患者相比，接受二甲双胍治疗的患者呈现出与相对改善代谢状态相关的基因表达模式。该研究的重要意义在于，其不是单纯停留于单基因或单通路观察，而是提出了基于患者来源数据、体外肝细胞模型和预测性基因-代谢物网络相结合的多层次分析框架，为后续治疗反应生物标志物研究提供了基于基因表达的候选线索。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究对象来自Sultan Abdülhamid Han Training and Research Hospital，共纳入4组受试者，每组20例，包括健康对照、糖尿病前期、未接受药物治疗的重度T2DM患者和接受二甲双胍治疗至少6个月的T2DM患者；同时采用HepG2细胞建立二甲双胍处理模型。先以MTT法测定细胞活力并确定二甲双胍半数抑制浓度（IC₅₀），再采用RT-qPCR检测46个代谢相关基因表达，以2^?ΔΔCt法计算相对表达量；对差异基因进行ShinyGO 0.82平台下的KEGG通路富集分析，并借助EnrichR与MetaboAnalyst 6.0开展预测性基因-代谢物关联网络分析。

3.1 Cell Culture
在细胞模型部分，研究人员首先通过MTT实验评价二甲双胍对HepG2细胞的细胞毒性与增殖抑制效应。结果显示，二甲双胍对HepG2细胞增殖具有时间依赖性抑制作用，48 h时IC₅₀为37.56 mM，72 h时IC₅₀为20.10 mM。该结果为后续细胞处理浓度的设定提供了依据，也表明在该体外模型中，二甲双胍可诱导可测量的细胞反应。

3.2 Gene Expression Analysis in Cell Model
在HepG2细胞中，研究人员通过RT-qPCR分析二甲双胍处理后的代谢基因表达变化。结果显示，二甲双胍下调了多条代谢途径相关基因的表达。脂质代谢方面，下调基因包括ACSS3、ACADL、CPT1C、ADCY3、ACSL1、ACSL3、ACSL4和SCD；糖代谢方面，下调了SLC2A7、SLC2A1、SLC2A2、HK2、TPI、PFKFB4和PGAM1；TCA循环方面，下调了LDHAL6A、OGDH、ACO2和FH；丝氨酸、甘氨酸及一碳代谢方面，下调了MTR、DHFR、DNMT1、MAT2A和PSPH；磷酸戊糖途径及氧化还原稳态方面，下调了TKTL1、PRPS1、G6PD、ME1和SLC7A11。该部分结果说明，在HepG2模型中，二甲双胍相关转录改变具有广泛性，涉及肝细胞能量代谢和生物合成网络多个关键节点。

3.3 Gene Expression Analysis in Patient Blood Samples
在患者血液样本分析中，研究人员以健康对照组为归一化参照，对糖尿病前期、重度未治疗T2DM和二甲双胍治疗T2DM三组进行比较。结果显示，糖尿病前期个体已出现与葡萄糖转运、糖酵解及脂质代谢相关基因的中等程度改变，提示代谢性转录异常早于临床显性糖尿病即已发生。将糖尿病前期个体与二甲双胍治疗T2DM患者相比，研究人员观察到葡萄糖代谢、脂质代谢和能量调控相关基因存在差异，KEGG分析进一步显示差异基因富集于糖酵解、脂肪酸代谢和氧化还原过程。该结果支持不同疾病阶段及治疗状态下代谢网络重塑模式存在差别。

当比较未接受药物治疗的重度T2DM患者与接受二甲双胍治疗的T2DM患者时，研究人员发现多个代谢通路相关基因表达发生变化。脂质代谢相关基因包括ACADL、CPT1C、ADCY3、PAHAF1B2、ACLY4、ACSL1、ACSL3、ACSL4、HMGCS1和SCD；糖代谢相关基因包括SLC2A1、SLC2A2、HK2、TPI1、ENO1、PFKFB4和PGAM1；TCA循环相关基因包括OGDH、ACO2、PDK2、FH和IDH1；丝氨酸、甘氨酸及一碳代谢相关基因包括MTR、DHFR、DNMT1、MAT2A和PHGDH；氧化还原平衡相关基因包括TKTL1、PRPS1和ME1。随后对变化幅度达到阈值的基因进行KEGG富集分析，结果提示受影响的主要是TCA循环、脂肪酸合成和碳水化合物代谢相关过程。该部分结果表明，二甲双胍治疗与多条核心代谢通路的转录重构相关。

3.4 Gene-Metabolite Interactions
为进一步从系统层面解释上述差异基因，研究人员采用EnrichR中的Metabolomics Workbench Metabolites 2022数据库预测相关代谢物，并使用MetaboAnalyst 6.0进行基因-代谢物网络构建与可视化。在糖尿病前期个体与二甲双胍治疗T2DM患者比较中，预测关联的代谢物包括ATP、辅酶A、NADP、棕榈酸、ADP、L-谷氨酸和草酰乙酸，涉及NME2、LDHAL6A、OGDH、GOT1、UCKL1、ACO2、FH、ACLY和ACADL等基因。在重度T2DM与二甲双胍治疗T2DM比较中，ATP、草酰乙酸、ADP、AMP、棕榈酸和NADP与NME2、G6PD、UCKL1、ACO2、FH、GOT1和ACLY等基因相关。该结果说明，二甲双胍相关差异基因与能量代谢、脂肪酸代谢和氧化还原平衡中的关键代谢物节点存在预测性联系，其中ATP、NADP和辅酶A等反复出现，提示其可能构成网络中的重要功能连接点。

讨论部分表明，研究结果支持T2DM是一种涉及多通路、多层级代谢紊乱的疾病状态，而二甲双胍治疗与这些异常网络的协同性转录调整相关。糖尿病前期个体已出现代谢基因表达改变，提示代谢失衡在临床确诊前即已启动。患者来源样本与HepG2模型在糖酵解、TCA循环和脂质代谢等方面呈现一定共享模式，说明HepG2模型能够反映部分肝细胞特异性代谢应答；但研究也明确指出，该模型缺乏全身性内分泌调控和胰岛β细胞激素相互作用，且作为肝细胞癌来源细胞，其葡萄糖和脂质代谢特征与正常肝细胞并不完全一致，因此不能直接等同于体内生理反应。此外，本研究还存在单中心、样本量中等、横断面设计、未控制BMI、病程及生活方式变量、缺乏蛋白水平和功能学验证，以及基因-代谢物关联仅为计算预测等局限。因此，文中对结论的表述保持审慎，强调结果主要提供基于基因表达的研究框架，而非直接证明功能因果关系。

研究结论部分可译为：
总之，本研究表明，二甲双胍治疗与2型糖尿病中广泛的代谢基因表达改变相关。尽管HepG2模型提供了有价值的机制性见解，但仍需在体内系统中开展进一步研究以验证这些发现。这些结果支持二甲双胍在T2DM管理中的既有作用，并突出其与代谢基因表达变化之间的相关性。