《Plant Biotechnology Journal》：Interactional Endocytosis and Transmembrane Transport Promote Cellular Internalization of Nano-Delivered RNA Drugs for Efficient Control of Crop Diseases
编辑推荐：
灰葡萄孢菌（*Botrytis cinerea*）是一种广泛分布的植物病原子囊菌，可在超过1400个物种上引起灰霉病，并对全球作物产量造成严重影响。双链RNA（dsRNA）诱导的基因沉默技术在害虫防治中具有广阔前景，但如何高效递送dsRNA仍是主要挑战。本研究
灰葡萄孢菌（*Botrytis cinerea*）是一种广泛分布的植物病原子囊菌，可在超过1400个物种上引起灰霉病，并对全球作物产量造成严重影响。双链RNA（dsRNA）诱导的基因沉默技术在害虫防治中具有广阔前景，但如何高效递送dsRNA仍是主要挑战。本研究开发了一种基于星形聚阳离子（SPc）的纳米递送平台，可增强dsRNA的内化效率，实现对灰葡萄孢菌的有效控制。SPc通过静电相互作用、氢键和范德华力与dsRNA自组装，形成稳定的纳米级复合物。SPc主要通过两种激活途径——内吞作用和跨膜转运，将dsRNA递送进入真菌菌丝体的效率提高2.19倍，分别使囊泡数量增加3.74倍，颗粒数量增加1.87倍。在这两种途径中，六个基因（*pkc*、*ypt10*、*pil1*、*mfs1*、*mfs2*和*mfs3*）在递送过程中发挥关键作用。通过RNA干扰、化学抑制和突变实验表明，这两种途径存在相互作用，共同优化了SPc负载dsRNA的细胞摄取过程。最终，研究人员开发了一种高效RNA杀菌剂，其在保护黄瓜叶片和番茄果实方面的效果与商业杀菌剂相当。本研究揭示了纳米载体介导基因递送的协同作用机制，并鉴定出关键基因，为RNA农药的设计与应用提供了理论支撑。
**纳米级dsRNA/SPc复合物的自组装与表征**
研究人员合成了SPc，并通过凝胶阻滞实验和等温滴定量热法（ITC）分析了其与dsRNA的组装机制。结果表明，带正电荷的SPc（64.94?mV）与带负电荷的dsRNA（?32.51?mV）主要通过静电相互作用结合，形成纳米复合物。ITC数据证实了该结合是一个自发过程，吉布斯自由能变化（ΔG）为负值（?51.74?kJ/mol），且具有高亲和力。反应焓（ΔH）和熵变（ΔS）的负值表明，氢键和范德华力也参与了复合物的形成。透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）观察显示，dsRNA与SPc复合后形态变为近球形，粒径增大至约193.3?nm。
**SPc介导的dsRNA稳定性、粘附性和摄取增强**
研究表明，SPc能有效保护dsRNA免受核酸酶降解。荧光标记实验证实，与裸dsRNA相比，SPc负载的dsRNA在灰葡萄孢菌菌丝体上的保留量更高，这是由于带正电荷的复合物与带负电荷的菌丝表面存在静电吸引。时间序列荧光观察和定量实时荧光PCR（qRT-PCR）显示，SPc能显著促进dsRNA在菌丝体内的积累，证实其作为递送载体能有效克服细胞壁/膜屏障。
**通过激活内吞作用和跨膜转运改善SPc负载dsRNA的递送**
对经SPc或dsRNA/SPc复合物处理的菌丝进行RNA测序（RNA-seq）分析，发现差异表达基因（DEGs）显著富集于内吞作用和跨膜转运相关通路。具体而言，内吞作用相关基因（如*pkc*、*ypt10*和*pil1*）和跨膜转运相关基因（如*mfs1*、*mfs2*和*mfs3*）表达显著上调。生物透射电镜直观观察到了SPc负载dsRNA通过两种途径进入细胞的过程：一种是经典的内吞途径，涉及囊泡形成和运输；另一种是颗粒直接穿过细胞膜的跨膜转运途径。定量分析表明，SPc处理使细胞内含物的囊泡数量和跨膜颗粒数量分别显著增加。
**两种递送途径中的关键基因鉴定**
研究人员利用RNA干扰技术分别下调每条途径中的候选基因。结果发现，敲低内吞途径的关键基因（*pkc*、*ypt10*或*pil1*）或跨膜转运途径的关键基因（*mfs1*、*mfs2*或*mfs3*），均能显著抑制SPc-荧光复合物的细胞摄取效率，证实了这些基因在各自途径中的核心作用。
**两种途径在SPc介导的dsRNA细胞摄取中存在相互作用效应**
为探究两种途径的关系，研究人员通过短期与长期RNA干扰、化学抑制剂（如氯丙嗪和巴弗洛霉素A）处理以及基因编辑技术构建突变体（*pkc*和*mfs3*突变株）进行深入分析。研究发现，短期抑制其中一条途径会抑制另一条途径相关基因的表达；而长期抑制则会激活另一条途径，形成一种代偿性响应。*pkc*或*mfs3*基因敲除突变株中，另一条途径的相关基因表达显著上调，且荧光复合物的摄取效率均低于野生型。这些结果表明，内吞作用和跨膜转运这两条途径并非完全独立，而是在转录水平上存在复杂的相互作用，共同调控外源物质的细胞内化过程。
**SPc基RNA杀菌剂对灰霉病具有优异的保护效果**
以靶向*dc12*和*iqg1*基因的dsRNA与SPc组装的复合物作为RNA杀菌剂，进行田间模拟防治试验。接触角和液滴保留量测试表明，该RNA杀菌剂在黄瓜叶面上的润湿性和附着性优于水对照。在黄瓜叶片和番茄果实的活体防治实验中，*dsdc12 + dsiqg1*/SPc复合物展现出最佳的保护效果，能将病斑面积相较于水对照显著缩小，其效果与商业杀菌剂相当。不含SPc的RNA制剂则无显著防治效果，证实了SPc在增强递送和保护dsRNA活性中的关键作用。
**讨论与结论**
本研究系统阐明了SPc纳米载体在递送dsRNA进入灰葡萄孢菌过程中的作用机制。首先，SPc通过自组装保护dsRNA稳定性并增强其在靶标表面的粘附性。其次，也是核心发现，SPc通过协同激活细胞内吞作用和跨膜转运这两条相互作用的途径，显著提高了dsRNA的细胞内化效率。研究不仅鉴定了两条途径中的六个关键基因，更揭示了它们之间存在复杂的、时间依赖的交叉调控关系。基于此机制开发的共靶向RNA杀菌剂，在离体和活体实验中均展现出与化学农药媲美的高效防治能力，且更环保、特异性更高。该工作为深入理解纳米载体跨越真菌生物屏障的分子机制提供了新见解，并为设计和开发下一代高效、安全的RNA农药提供了重要的理论依据和纳米平台。论文发表于《*Plant Biotechnology Journal*》。
