《International Journal of Biomaterials》：Revisiting ISO 10993-5 In Vitro Cytotoxicity Standard Tests for Evaluation of Extracellular Matrix-Based Biomaterials
细胞毒性测试是生物材料和医疗器械临床前评估的关键步骤，其中基于细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的生物材料构成了一个重要类别。当前的ISO 10993-5:2009标准《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性测试》规定了四种代谢检测法，这些方法主要依赖比色法和集落形成法。然而，仅依赖比色检测或集落形成法无法精确反映细胞功能/活性，且可能产生假阳性结果，导致实验室间数据差异。本研究系统评估了ISO 10993-5推荐的检测方法在ECM基商业产品上的应用，具体评估了关键检测变量的影响，包括细胞类型、接触方式（测试提取物与测试材料本身）和培养基成分（有或无血清）对生物学结果的影响。这些评估有助于开发更准确和稳健的测试方法。虽然所有四种检测方法均表明测试样品为非细胞毒性，但代谢活性读数根据血清的存在与否、细胞类型以及所采用的检测方法而存在显著差异。为解决这些局限性并实现对细胞活性更精确的评估，研究人员分析了细胞膜完整性（活/死染色）、细胞-ECM附着（肌动蛋白骨架）、增殖（Ki67）和凋亡（annexin V）。值得注意的是，尽管在无血清条件下通过MTT和XTT检测测得的代谢活性增加（100%–150%），但活/死和肌动蛋白染色显示细胞活力或附着并未发生相应变化，Ki67仅显示约15%的增殖。Annexin V染色仅在人原代皮肤成纤维细胞中检测到，突显其比L929细胞在检测凋亡方面更具可靠性。这些发现为研究人员、监管机构和行业利益相关者在完善细胞毒性测试方案和指导未来ISO 10993-5修订以更可靠地评估生物材料和医疗器械方面提供了有价值的参考。
生物相容性评估是医疗器械开发和监管认可中的关键环节，旨在确保其对人体使用的安全性和有效性，并获得市场准入[1]。各国关于生物相容性测试和医疗器械的法规存在差异。然而，国际标准化组织（International Organization for Standards, ISO）10993系列、经济合作与发展组织（Organization for Economic Cooperation and Development, OECD）测试指南（Test Guidelines, TGs）、美国材料与试验协会（American Society for Testing and Materials, ASTM）国际、美国食品药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration, FDA）、欧洲医疗器械法规（European Medical Device Regulation, MDR）、医药品和医疗器械机构（Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, PMDA）、美国药典（US Pharmacopeia, USP）、加拿大卫生部法规指南、欧洲药品管理局（European Medicines Agency, EMA）等国际公认标准和法规，被医疗器械行业普遍遵循[1, 2]。其中，依据ISO 10993-5:2009进行的体外细胞毒性测试是所有联邦机构、公告机构和监管机构为证明医疗器械安全性所要求的基本测试方法[3, 4]。该标准由ISO/技术委员会（Technical Committee, TC）194制定，概述了用于进行医疗器械生物学评估的公认体外细胞毒性测试方法和方案[2, 3]。这些评估通常涉及将培养的细胞与医疗器械或其提取物直接接触，或通过琼脂覆盖法或滤膜扩散法等技术进行间接接触[3, 5]。医疗器械测试的样品制备和参考材料选择依据ISO 10993-12:2021标准指南执行[6]。ISO 10993-5:2009标准详细列出了四种具体测试：3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT）、2,3-双-[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-羧基苯胺-2H-四唑（2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-carboxanilide-2H-tetrazolium, XTT）、中性红摄取（Neutral Red Uptake, NRU）和集落形成法（Colony Formation Assay, CFA）[3]。细胞毒性通过定性或定量方式检测细胞死亡或损伤进行评估。定性分析涉及显微镜下观察细胞形态变化，如形状改变、空泡化、脱落、裂解和膜完整性，按0至4级进行分级。定量分析则通过基于细胞代谢的比色检测或CFA来测量细胞损伤/生长[3, 6–10]。根据标准，当与测试提取物接触培养的细胞表现出大于或等于（≥）对照组70%的代谢活性时，该材料被视为非细胞毒性[3, 11]。
尽管ISO 10993-5:2009测试方法被广泛使用，但标准中推荐的方法主要基于代谢活性的比色评估，可能无法明确预测材料-细胞相互作用，从而引发了对其有效性的担忧。大量研究已指出了这些体外细胞毒性检测的关键局限性，并强调了在设计研究方案、进行实验、分析数据和解释结果时必须考虑的关键因素[2, 7–19]。表1详细概述了这些测试方法，图1展示了其实施的主要步骤。例如，据报道，各种化学化合物，包括抗氧化剂、抗坏血酸、生育酚、二氢硫辛酸、谷胱甘肽、谷胱甘肽-S-转移酶、辅酶A、半胱氨酸、多酚类化合物、超氧化物和胆固醇，会干扰MTT和XTT等细胞毒性试剂，导致检测结果改变[20, 38–40]。此外，基于细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的支架具有复杂且精细的生物化学组成，包括胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖（Glycosaminoglycans, GAGs）、蛋白聚糖、糖蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、层粘连蛋白、整合素、生长因子（Growth Factors, GFs）和基质金属蛋白酶，这些成分可通过吸附、隔离或中和检测试剂、改变其反应性并掩盖毒性效应来干扰常规细胞毒性评估，从而降低细胞毒性检测的灵敏度，并可能导致从不可接受到优异的误导性或不确定结果[21, 41–43]。ECM基生物材料的另一个难点在于其批次间不一致性，这影响了在ISO 10993-5条件下的可重复性，同时提取物制备也面临挑战，因为ECM支架可能降解或膨胀不一致，使得提取过程非标准化且不可预测。其他影响检测结果的变量包括提取介质中血清的存在和浓度、暴露方法、培养条件、细胞类型、细胞接种密度、细胞生长期以及细胞-材料相互作用的性质（如直接接触与基于提取物的暴露）[9, 10, 13, 14, 16, 18, 19, 41]。此外，检测试剂长时间暴露于光照以及培养基中pH值升高也可能导致背景吸光度升高，从而增加假阳性或错误结果出现的可能性[12]。表2总结了批判性评估将ISO 10993-5:2009测试方法应用于各种生物材料时局限性的研究。这凸显了ISO 10993-5标准实现一致适用性所面临的挑战。
因此，本研究系统地评估了ISO 10993-5推荐的体外细胞毒性检测方法在ECM基生物材料背景下的应用，重点关注关键变量，如细胞类型、接触类型（测试提取物或测试材料本身）和培养基成分（±血清）对细胞活力结果的影响，使用市售ECM基产品进行评估。虽然ECM生物材料在多种临床应用中因其细胞相容性而闻名，但它们在化学、生物学和物理性质方面可能存在批次间差异。化学成分，包括组织来源特性、ECM组成、生物活性分子、脱细胞方法（物理、化学或酶解）、脱细胞效率、交联剂、残留化学物质、灭菌方法、储存条件以及降解产物，都会影响细胞毒性并调节细胞行为，如粘附、分化和迁移[29, 48]。此外，物理性质（如孔隙率、机械性能和降解速率）的批次间差异会影响细胞-材料相互作用，从而影响细胞毒性检测读数[15, 42, 43, 49, 50]。在本研究中，主要评估了一种来自Cook Biotech（现为Evergen, USA）的ECM基支架，即来自小肠粘膜下层（Small Intestinal Submucosa, SIS）天然ECM的Biodesign1-Layer Tissue Graft。该支架在临床上用于加强软组织，并应用于疝气修复、瘘管修复和耳科修复等手术[51]。另一种ECM基产品，来自Aroa Biosurgery Ltd.（新西兰）的Endoform Natural Restorative Bioscaffold，也作为对照进行了测试。Endoform支架基于反刍动物前胃ECM，用于急性伤口和慢性伤口的管理[52, 53]。两种支架均通过环氧乙烷进行终端灭菌，并为一次性使用。最初，使用ISO 10993-5推荐的测试评估了血清（±胎牛血清[Fetal Bovine Serum, FBS]）存在与否对ECM基生物材料细胞毒性测量的影响。此后，通过使用ISO 10993-5中概述的多种细胞类型进行推荐测试，评估了细胞类型特异性的对ECM基生物材料的反应。最后，使用目前未包含在ISO 10993-5标准中的活/死染色、细胞骨架肌动蛋白免疫染色、通过Ki67免疫染色评估增殖以及使用annexin V染色评估凋亡来评估细胞相容性。通过将这些方法与推荐的比色检测进行直接比较，旨在确定ISO 10993-5标准是否需要修订。与传统的比色检测相比，这些替代方法可能提供一种更快捷、更简便的方式来深入了解细胞功能，同时对细胞对生物材料的反应提供更深入、更全面的评估。
本研究使用了猪源SIS基支架（Biodesign 1-Layer Tissue Graft, Cook Biotech, 现为Evergen, USA）和反刍动物前胃ECM基支架（Endoform Natural Restorative Bioscaffold, Aroa Biosurgery Ltd., New Zealand），分别称为SIS1和EF。两种支架均无菌提供。测试样品与阳性毒性对照（Positive Control, PC；0.1 mg/mL十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠；Sodium Dodecyl Sulfate/Sodium Lauryl Sulfate, SDS/SLS）和仅细胞对照（即在无任何处理的组织培养聚苯乙烯（Tissue Culture Polystyrene, TCPS）上生长的细胞）进行比较。研究还评估了测试和培养基条件中血清（FBS）的影响。对于提取物测试，样品按照ISO 10993-12:2021标准提取，推荐提取比例为每毫升提取体积对应6 cm
2表面积或0.1 g样品质量。简而言之，将测试样品与含或不含（Without, W/O）FBS（± FBS）的培养基在37°C ± 1°C下以100 rpm轻柔振荡孵育24 ± 2小时，以提取潜在的可浸出物。孵育后，通过倾析分离测试提取物，定义为100%提取物。随后，使用含± FBS的培养基稀释100%提取物，得到不同稀释度的提取物，如50%、25%和12.5%。对于Endoform和细胞对照，分别使用100%测试提取物或100%相关细胞培养基± FBS。然后将提取物在CO
2培养箱中37°C ± 1°C下培养单层细胞24 ± 2小时。根据10993-5标准，L929、BALB/c 3T3和V79-4细胞分别用于直接接触、MTT、XTT、NRU和CFA检测。HDF和Caco-2细胞也作为对照用于评估。对于直接接触测试，将测试样品无菌冲压成所需尺寸，直接置于L929细胞接触中，或将细胞直接接种到测试材料上。孵育后，通过分析以下项目评估细胞毒性：(i) 细胞形态（根据ISO 10993-5标准按0-4级评分），(ii) ISO 10993-5推荐的代谢检测，如MTT、XTT、NRU和CFA，以及(iii) 染色方法，如活/死检测、肌动蛋白骨架和增殖标志物Ki67免疫细胞化学，以及凋亡标志物annexin V染色。染色方法使用L929和HDF细胞进行。
关键的技术方法包括：使用商业化的ECM基支架产品（猪源小肠粘膜下层支架和反刍动物前胃支架）作为测试材料；系统评估血清（±FBS）存在与否对标准比色检测（MTT, XTT, NRU, CFA）结果的影响；采用多种细胞系（L929, BALB/c 3T3, V79-4）和原代人细胞（人真皮成纤维细胞HDF, 人结肠癌细胞Caco-2）以评估细胞类型特异性反应；以及通过活/死染色、肌动蛋白骨架免疫荧光染色、Ki67增殖标志物免疫染色和annexin V凋亡染色，来表征细胞在支架上的活力、附着、增殖和凋亡状态，从而提供超越标准代谢活性的更全面的细胞功能信息。
研究结果部分标题如下：
3.1. ISO 10993:5推荐代谢检测对ECM生物材料细胞毒性评估的影响
研究人员首先比较了ISO推荐的检测方法，以检验评估ECM基生物材料细胞毒性时潜在的差异。L929细胞用于进行MTT和XTT检测，BALB/c 3T3细胞用于NRU检测，V79-4细胞用于CFA检测，均依据ISO 10993-5标准。不同稀释度的测试提取物的代谢活性百分比与未处理的细胞对照（即在TCPS上无任何处理的细胞）和阳性毒性对照（PC; 0.1 mg/mL SDS/SLS）进行比较。所有检测均在含± FBS的测试提取和培养基条件下进行。细胞代谢活性或活力百分比通过将光密度与未处理细胞对照归一化计算得出。较低的活力百分比表示测试项目具有较高的细胞毒性潜力。当空白的平均光密度（Optical Density, O.D.）值≥ 0.3，且空白左右两侧的平均O.D.值与所有空白的平均值相差不超过15%时，测试符合质量接受标准[3]。阳性对照（PC）在所有检测中均表现出预期的细胞毒性反应，在± FBS培养组中代谢活性百分比均低于70%（图2(a)和2(b)）。SIS1支架的测试提取物在所有稀释度下均无细胞毒性，在所有检测中，无论± FBS培养组如何，代谢活性百分比均高于70%（图2(a)和2(b)）。同样，Endoform的100%测试提取物在所有检测中也表现出高于70%的代谢活性（图2(a)和2(b)）。有趣的是，当测试提取和培养基中不含FBS时，不同稀释度的SIS1提取物在MTT和XTT检测中表现出显著更高的代谢活性（图2(b)）。这种效应在NRU检测以及Endoform支架提取物中并未观察到（图2(b)）。在CFA中，培养物中形成的平均菌落数量表明了测试处理后的细胞存活率，接种效率（Plating Efficiency, PE）百分比可通过将总菌落数与未处理细胞对照归一化来估算。在含FBS的测试提取和培养基中，菌落数量更高。与细胞对照相比，在± FBS条件下，两种ECM基支架的100%测试提取物的PE均高于70%，进一步证实了支架的非细胞毒性特性（图2(c)和2(d)）。所有四种检测（MTT、XTT、NRU和CFA）均表明SIS1和Endoform支架无细胞毒性；然而，代谢活性读数受FBS存在和检测类型的影响很大。特别是，SIS1支架在MTT和XTT检测中，在无FBS条件下的代谢活性读数显著更高，表明血清对检测结果存在干扰。有趣的是，这种趋势在NRU检测中未观察到。这可能是因为NRU检测评估细胞膜完整性和活力，能更精确地反映整体细胞健康状况[30]。相比之下，MTT和XTT检测测量线粒体活性，这可能在濒死的细胞中仍然活跃，从而可能导致高估细胞活力[11]。先前的研究已证明，不同的细胞毒性测试可能导致不同的细胞相容性结果[22, 33, 54]。细胞酶、蛋白质、脂质和培养基及血清中的特定成分据报道可以还原四唑盐或溶解甲臜染料，可能影响读数[12, 23, 24, 55]。MTT的还原不仅限于线粒体，也发生在细胞质和非线粒体位点，包括内体、溶酶体和质膜，在某些情况下甚至可能通过非细胞机制进行[38, 44, 56]。无FBS条件下代谢活性较高的另一个潜在解释是SIS1支架固有的存在生物活性因子，如蛋白质、GFs或其降解产物，在无FBS时可能增强细胞代谢。这是合理的，因为SIS1支架来源于ECM。提取介质中无FBS也可能增强支架中代谢支持性生物活性因子向培养基的洗脱。例如，先前有报道称，提取介质中的血清会导致纤连蛋白和白蛋白的蛋白质层立即覆盖在材料表面，从而使生物材料钝化[10, 14]。这可能会限制生物活性成分从支架释放到测试提取介质中，这或许解释了为什么仅在无FBS条件下观察到SIS1提取物的代谢活性增加。当SIS1和Endoform材料与含FBS的提取介质孵育时，观察到培养基颜色显著变黄，这可能是由于pH值变化所致[57]。这可能是由于FBS蛋白与测试材料的相互作用和粘附，这也会耗尽测试提取介质中的血清蛋白并导致pH偏移。
仅依赖代谢活性的检测的一个局限性是无法区分整体代谢率变化与细胞数量或活力变化。代谢活性可能因多种因素而发生显著变化，包括细胞应激、营养剥夺和/或不同细胞表型之间固有的代谢率差异[9, 26, 58]。为确保全面的细胞毒性评估，并考虑到细胞类型特异性效应的潜在影响，研究人员评估了不同细胞类型对ISO 10993-5检测细胞毒性结果的影响。
3.2. 细胞类型对使用ISO推荐检测评估ECM生物材料细胞毒性的影响
ISO-10993-5标准推荐使用永生化细胞系进行生物材料细胞毒性评估，因为它们具有标准化特性、相对易于使用和成本效益高。然而，永生化细胞系不能准确复制原代细胞对生物材料的反应。例如，ISO 10993-5测试中常用的L929小鼠成纤维细胞系，已知对某些测试试剂的毒性具有抵抗力，这限制了其作为体内细胞毒性预测指标的适用性[59]。ISO 10993-5标准中也推荐的BALB/c 3T3或V79-4细胞，来源于小鼠/仓鼠，可能无法完全代表人类细胞的反应和对毒素的敏感性，可能导致毒性评估不准确。不同细胞类型对MTT等试剂的细胞膜通透性也可能不同[60]。研究人员使用原代细胞和不同细胞系进行了MTT、XTT和NRU检测，以研究细胞类型如何影响SIS1支架的细胞毒性评估。评估了原代HDF对SIS1支架的代谢反应，并与L929和3T3细胞系以及癌细胞系（Caco-2）进行比较。总体而言，SIS1测试提取物在任何条件下均未显示任何细胞毒性效应，代谢活性读数等于或高于细胞对照（图3(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)）。有趣的是，细胞类型特异性反应仅在无FBS条件下观察到。例如，在无FBS条件下的MTT检测中，L929细胞表现出比HDF和Caco-2细胞显著更高的代谢活性（图3(b)和3(d)）。这些结果表明，与原代细胞相比，L929细胞在无FBS条件下能够更轻松地存活并维持功能。这种鲁棒性可能限制了L929细胞在旨在复制生物材料在原代细胞中观察到的更敏感细胞反应的研究中的效用。值得注意的是，L929细胞代谢活性的显著增加仅在MTT检测中观察到，这强调了在从ISO-10993-5推荐测试得出结论之前，采用多种检测类型和细胞类型的重要性。此外，这些细胞可能无法反映与ECM支架相互作用的实际细胞类型（如干细胞、内皮细胞和免疫细胞），从而导致误导性的毒性谱。综上所述，这些结果表明建议在测试生物材料细胞毒性时采用包括原代细胞在内的细胞类型组合。研究结果还表明，ISO-10993-5检测应在存在或不存在FBS的测试条件下进行，以确保准确的细胞毒性评估。
3.3. 细胞-生物材料接触类型对细胞毒性结果的影响
根据ISO 10993-5，细胞毒性评估在生物材料接触后进行，接触方式可以是直接的（直接接触或提取物测试），也可以是间接的（通过琼脂或滤膜扩散等方法）[3, 5]。聚焦于直接接触评估，研究人员使用(i) 支架提取物暴露（提取物测试）和(ii) 与支架材料本身的直接接触两种方式评估了SIS1支架的细胞毒性（图4(a)和4(b)）。这些检测使用L929细胞按照ISO 10993-5进行，细胞反应通过显微镜检查，特别关注细胞形态和细胞质完整性。在提取物测试条件下，评估了浓度为100%、50%、25%和12.5%的SIS1提取物以及Endoform的100%提取物。对于直接接触测试，根据ISO 10993-5指南，将单个测试样品置于每个培养容器的中央，覆盖约十分之一的细胞单层表面。使用SpongeCol作为非细胞毒性生物材料支架（阴性对照，Negative Control, NC）和毒性PC（0.1 mg/mL SDS/SLS）进行比较，并设有细胞对照。SpongeCol是一种柱状互穿多孔胶原（牛纯化I型胶原）海绵，支持细胞附着和增殖（SpongeCol; Sigma, USA）[61]。与NC生物材料接触的细胞保持正常形态（0级），而PC生物材料表现出3级或4级特征，超过70%的细胞变圆或裂解，细胞层几乎完全破坏。在提取物测试和直接接触两种条件下，SIS1支架均显示出非细胞毒性特性，与NC对照（0级）相比，细胞形态、裂解或生长未观察到可辨别的变化（图4(a)和4(b)）。两种测试材料接触条件之间未观察到明显差异。如果材料释放出细胞毒性可浸出物，或者直接表面接触独立于可提取成分诱导细胞应激，则可能预期这两种接触条件之间存在差异。在本研究中，未检测到提取物测试和直接接触条件之间在细胞形态、裂解或生长方面的可观察差异。这表明SIS1测试支架在生物学相关浓度下不会释放细胞毒性可溶性成分，且与支架表面的直接物理接触不会对细胞活力或形态产生不利影响。
接下来，使用MTT检测比较了暴露于SIS1测试提取物（提取物测试接触）的细胞和直接接种（直接接触）在SIS1测试材料上的细胞的代谢活性，使用L929、HDF和Caco-2细胞（图4(c)、4(d)和4(e)）。将细胞直接接种到测试支架上评估了表面介导和物理相互作用，这些相互作用可影响细胞粘附、形态和生长，而暴露于测试支架提取物则评估了可溶性可浸出物的毒性。在体内，细胞以复杂的、动态的方式与ECM相互作用，影响其功能和活力。支架的结构影响营养扩散、氧气供应和废物清除，而其刚度影响机械转导途径，表面地形，包括粗糙度和微/纳尺度图案，调节细胞粘附和细胞骨架组织，从而影响整体细胞存活[62, 63]。这些接触条件之间缺乏差异表明该支架在化学上无细胞毒性，并支持正常的细胞-材料相互作用。在无FBS条件下，L929细胞在SIS1提取物测试条件下观察到显著更高的代谢活性，与未处理的细胞对照和含FBS组相比（图4(c)）。这与之前的结果一致，表明SIS1测试提取物中的生物活性成分可以促进L929的代谢活性。当使用原代HDF细胞进行MTT检测时，在± FBS组中，接触类型之间未观察到显著差异（图4(d)）。同样，当使用Caco-2细胞时，测试条件之间未观察到显著差异（图4(e)）。L929细胞代谢活性的增强可能是由于细胞类型与ECM支架的特异性相互作用（如配体类型和整合素表达）或细胞类型特异性的代谢需求。ECM基生物材料可以通过影响粘附、增殖和代谢活性来影响细胞行为[42, 49]。在ECM支架上或内部培养的细胞可能采用与标准二维培养不同的代谢状态，使得与传统代谢检测的直接比较不可靠[43, 49]。标准代谢检测和规范可能无法完全捕捉这些相互作用，导致体外和生理条件之间的差异。
3.4. 结合染色方法进行细胞毒性评估
除了依赖化学读数的比色代谢检测或集落计数外，另一种方法是通过随时间测量特定标志物的表达来评估生物结果，如细胞粘附、增殖、DNA合成、细胞周期进程、衰老以及凋亡或坏死的指标，从而提供更具生理相关性的评估。活/死染色是一种简单的双重荧光染色技术，通过使用钙黄绿素AM（Calcein AM）和乙锭同源二聚体-1（Ethidium Homodimer-1, EthD-1）染料评估细胞内酯酶活性和膜完整性，同时区分活细胞和死细胞，从而清晰区分这两个群体。与代谢活性的群体平均评估相比，这提供了关于细胞反应的更精确信息。研究人员比较了来源于小鼠（L929细胞）和人（HDF）的成纤维细胞在测试SIS1材料上直接接触和提取物测试条件下培养的活/死染色结果，并与细胞对照进行比较（图5(a)和(c)）。在24小时和72小时后，两种细胞类型在直接SIS1支架接触组和提取物测试接触组中均保持活力，表明SIS1支架的非细胞毒性特性（图5(a)和(c)）。在直接SIS1支架接触组中，细胞形态更呈纺锤形，这可能是由于3D支架的纤维和多孔特性相较于2D培养条件所致（图5(a)和(c)）。使用FIJI图像分析软件进行细胞活力定量分析显示，在含FBS组中，两种接触条件下，24小时和72小时后，基于样本总细胞计数的细胞活力范围为90%–95%（图5(b)和(d)）。在无FBS测试条件下，两种细胞类型在直接接触和提取物测试组中的细胞数量均略低于细胞对照。尽管这种差异未反映在百分比活力数据中，但在定性成像结果中可见（图5(a)和(b)）。L929细胞在24小时直接接触组中显示出显著的活力增加，而到72小时时，在两种接触条件下，与各自的对照相比，细胞活力保持不变。在无FBS条件下，L929细胞在24小时提取物测试组中表现出显著的活力增加，但在72小时的任何接触条件下均未观察到显著差异。相比之下，HDF细胞在含FBS条件下，无论处于直接接触还是提取物测试组，在24小时和72小时均保持显著更高的活力。然而，在无FBS条件下，HDF细胞仅在24小时显示出显著的活力增加，在72小时观察到的差异很小（图5(c)和(d)）。值得注意的是，活/死染色结果并未重复MTT和XTT检测中观察到的增加。这些差异可能是因为代谢检测反映了整体的酶活性，即使在受压的细胞中也可能暂时升高，而活/死染色直接评估细胞膜完整性和酯酶活性，提供了更准确的细胞真实存活率衡量标准。
接下来，使用罗丹明-鬼笔环肽肌动蛋白染色检查了直接接触和提取物测试条件下肌动蛋白细胞骨架组织的改变。F-肌动蛋白染色能够评估细胞铺展、粘附和细胞骨架组织，为材料诱导的效应（如细胞应激、凋亡或细胞毒性）提供见解[64, 65]。对小鼠来源（L929）和人来源（HDF）的成纤维细胞进行了比较分析。肌动蛋白染色显示，在直接支架接触和提取物测试条件下，细胞铺展良好且细胞骨架发达，进一步证实了SIS1支架在两种细胞类型中的细胞相容性（图6(a)和(c)）。通过测量校正总细胞荧光（Corrected Total Cell Fluorescence, CTCF）来量化荧光强度值，CTCF可校正背景荧光以量化单个细胞或细胞内特定感兴趣区域的荧光强度。在含FBS的直接接触和提取物测试组中，两种细胞类型均未显示出CTCF值的显著增加。然而，L929细胞在24小时提取物测试组中CTCF值降低，HDF细胞在接触类型之间显示出CTCF值降低（图6(b)）。在无FBS条件下，L929细胞在24小时提取物测试组和72小时直接接触组中显示出肌动蛋白CTCF值降低。在比较24小时至72小时时，在两种接触类型中，L929细胞也观察到肌动蛋白CTCF值随时间依赖性下降。同样，与各自的对照细胞相比，HDF细胞在所有接触组和时间点均表现出降低的肌动蛋白CTCF值（图6(d)）。有趣的是，在无FBS条件下，肌动蛋白免疫染色未显示在直接接触或提取物测试条件下CTCF显著增加，这与MTT和XTT检测获得的代谢活性结果形成对比。这种差异可能表明，虽然细胞代谢仍然可检测，但在无血清条件下，细胞骨架组织和附着可能受到轻微损害。
评估细胞毒性或生物相容性的另一个参数是评估接种在生物材料上的细胞的增殖率。较低的细胞增殖可能表明生物材料具有细胞毒性效应，而未受影响或较高的增殖表明与细胞生长和活力相容。Ki67染色用于测量与SIS1支架接触的细胞的增殖。采用了两种接触方式：直接接触和通过支架提取物进行间接接触，并在24小时和72小时比较了小鼠（L929）和人来源（HDF）成纤维细胞之间的增殖情况（图7(a)、(b)、(c)）。在含FBS组中，Ki67阳性率在直接接触和提取物测试条件之间具有可比性，并且与含血清（FBS）的细胞对照中观察到的相似（图7(a)和(b)）。在无血清条件下，与对照相比，两种接触类型和细胞类型中的Ki67阳性率均降低，在72小时HDF细胞的接触类型之间存在显著差异（图7(a)和(c)）。有趣的是，尽管无血清条件下细胞数量减少，但这种减少并未在Ki67阳性率中成比例反映，表明尽管整体存在应激，但仍有部分细胞保留增殖能力。结果还强调了在实验读数中纳入额外时间点的重要性，以捕捉超出大多数ISO 10993-5检测推荐的24小时窗口的细胞活性。结果表明，从ECM支架释放的生物活性因子可能对细胞增殖有适度影响。最后，使用annexin V-PE染色检测在与SIS1支架直接接触和提取物测试条件下培养24小时后，L929和HDF细胞的凋亡情况（图8(a)、(b)和(c)）。有趣的是，在L929细胞的任何组中均未观察到阳性染色，而HDF细胞在含血清和无血清组中均表现出0.6%至9.3%（低于10%）的凋亡（图8(a)、(b)和(c)）。这突显了细胞系对细胞毒性刺激的敏感性可能存在差异，HDF细胞比L929细胞更敏感，表明人源细胞系可能更有效地检测细胞毒性的细微变化。
研究结果突显了仅依赖单一代谢活性检测（如ISO 10993-5推荐的MTT、XTT、NRU或CFA）评估ECM基生物材料细胞毒性的局限性。具体而言，尽管MTT和XTT检测在无血清提取物条件下显示代谢活性增加，但活/死和肌动蛋白染色并未显示细胞活力的相应增加。虽然在无血清条件下支架提取物的细胞增殖显示出适度增加，但这远低于100%–150%的代谢活性增加。此外，使用不同代谢指标的NRU检测并未显示代谢活性增加。这些结果表明，代谢读数的增强是由于特定支架成分对检测试剂的干扰，而非支架中固有的促有丝分裂或生物活性因子所致。这突显了使用单一检测监测细胞毒性的局限性，并表明应采用多模式表征技术。这些发现进一步强调了在设计测试规范时考虑各种参数的必要性，包括细胞类型的选择、材料-细胞接触的类型，以及ECM基生物材料中FBS的潜在干扰。验证染色检测方法以将其纳入ISO标准细胞毒性测试，需要全面评估关键参数：特异性、灵敏度、准确性、精密度、可重复性和稳健性。特异性通过与适当的对照比较结果来评估，以确保选择性检测目标细胞状态（如活力、凋亡、增殖），而无干扰或交叉反应。灵敏度通过将细胞暴露于一系列已知细胞毒性剂的浓度来测试，确认检测对细胞反应细微变化的检测能力。准确性通过将检测结果与已建立的ISO批准方法（如MTT、XTT或NRU）获得的结果进行比较来确定。精密度通过在多天内进行检测来评估结果的一致性。可重复性通过在不同的操作者和实验室中进行检测来确认。稳健性通过引入微小的程序变化（例如，孵育时间或试剂浓度±10%）来测试，并验证结果是否在可接受的变异阈值内（通常小于10%）。在本研究中，研究人员评估了几种推荐染色方法（活/死、肌动蛋白骨架、Ki67增殖和annexin V凋亡）的特异性、准确性和精密度。
评估细胞膜完整性（活/死）、细胞附着（肌动蛋白）、增殖（Ki67）和凋亡（annexin V）为细胞对ECM基生物材料的反应提供了比标准ISO 10993-5检测（MTT、XTT、NRU和CFA）更全面的评估。尽管大量研究已强调了ISO 10993-5标准中概述的检测的局限性，如表2所示[9–11, 13, 14]，但本研究在ECM基支架的背景下对ISO 10993-5推荐的检测进行了全面评估。自1992年首次发布以来，ISO 10993-5标准已经过两次修订，最近一次更新是在2009年[9]。ISO 10993-5中提供的指南缺乏足够的具体性，无法明确确保不同实验室和生物材料之间结果的可靠性和可比性，以确保同一医疗器械的结果一致且可比[9]。本研究强化了将ISO 10993-5标准置于背景中以纳入更好的规范和检测的重要性，这些检测应评估更广泛的细胞反应，如本研究中使用和证明的那样。考虑诸如新兴类别的生物材料、提取条件、接触或细胞类型、先进方法和生物标志物，以及潜在的干扰源（如FBS）等因素，将提高生物材料体外细胞毒性测试的精确度和稳健性。
研究结论部分翻译如下：
研究表明，用于生物材料细胞毒性测试的ISO 10993-5标准虽然有价值，但可以加以改进，以实现对ECM基生物材料更全面的表征。本研究系统评估了ISO 10993-5标准推荐的检测方法，重点关注关键变量，包括细胞类型、接触类型（与测试提取物或材料本身）和培养基成分（±血清），展示了单独使用这些检测时的相关缺点。在不同比色检测（MTT、XTT、NRU和CFA）之间观察到细胞反应的显著差异，突显了试剂/血清蛋白可能干扰这些检测的可能性。此外，研究结果强调了除了ISO 10993-5推荐的标准细胞系外，使用与预期应用相关的原代/人细胞系的重要性。为了实现对ECM基生物材料细胞毒性更全面的评估，研究建议将ISO推荐的比色测试与能提供更详细细胞行为信息的检测方法相结合，包括活/死染色、细胞骨架肌动蛋白分析、增殖（Ki67）和凋亡标志物（annexin V染色）等技术。这些改进有可能通过提供更准确和可靠的生物材料细胞毒性评估来简化临床前评估，最终减少生物材料开发的时间和成本。
论文发表在《International Journal of Biomaterials》上。
